Method Article

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

DOI:

10.3791/61237

⸱

May 22nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 인터페이스에서 단백질 상호 작용은 조직 발달과 암 진행에서 시냅스 형성 및 유지 보수에 이르기까지 다양한 생물학적 결과를 지시합니다. 이러한 근본적인 상호 작용의 대부분은 트랜스에서 발생하고 일반적으로 막 고정 결합 쌍을 표현하는 세포 사이의 이기성 또는 동종 작용에 의해 유도된다. 질병 관련 돌연변이가 어떻게 이러한 근본적인 단백질 상호 작용을 방해하는지 설명하면 무수한 세포 생물학 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 많은 단백질 단백질 상호 작용 소법은 전형적으로 시스와 트랜스 상호 작용 사이에 비약적이지 않으며, 이는 잠재적으로 생체 내에서 발생하는 결합의 정도의 과대 평가로 이어지고 단백질 및 /또는 전문 모니터링 장비의 노동 집약적 정제를 포함합니다. 여기서, 우리는 긴 단백질 정제 또는 특수 장비없이 트랜스 상호 작용의 관찰 및 정량화를 허용하는 최적화 된 간단한 프로토콜을 제시한다. HEK 세포 집계 분석법은 HEK 세포의 2개의 독립적인 인구의 혼합을 관련시킵니다, 각각 막 결합 된 cognate 리간드를 표현합니다. 짧은 잠복기 후에 는 샘플이 이미지화되고 결과 골재가 정량화됩니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시냅스 접착 분자에 의해 촉진되는 시냅스 상호 작용은 시냅스의 개발, 조직, 사양, 유지 보수 및 기능 및 신경망 의 생성을 위한 기초입니다. 이러한 신혈 세포 접착 분자의 식별은 급속히 증가하고 있습니다. 따라서, 결합 파트너를 식별하고 이러한 새로운 접착 분자가 서로 상호 작용하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요합니다. 추가적으로, 게놈 순서는 일반적으로 신경 발달, 신경 정신병및 중독무질서1의 다수에 연결되는 이 접착 분자의 많은에서 돌연변이를 확인했습니다. 시냅스 세포 접착 분자에 대 한 코드 유전자에 돌연변이 는 해로운 트랜스 상호 작용을 변경 하 고 시 냅 스 형성 및 유지 보수에 병 리 학적 변경에 기여할 수 있습니다.

여러 분석법은 이소성 열량, 원형 이윤술, 표면 플라스몬 공명2와 같은 단백질 단백질 상호 작용을 정량적으로 평가하기 위해 존재하며 자연에서 정량적이지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 그들은 재조합 단백질을 필요로, 때로는 길고 지루한 정제 단계를 요구. 둘째, 정교한 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 셋째, 생체 내 막에 자연적으로 테더드되는 단백질 간의 시스 및 트랜스 상호 작용을 모두 허용하므로 결합의 정도....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 배양 및 형질

  1. DMEM, 1x (덜벡코의 독수리 매체 수정)로 HEK 세포 미디어를 4.5 g/L 포도당, L 글루타민 및 나트륨 피루바테 및 10% FBS로 보충합니다. 멸균 필터.
  2. 집계 분석에 적합한 리간드 및 수용체를 미리 결정합니다.
    참고: Neurexin3α SS4+/-와 알려진 리간드 중 하나인 LRRTM2가 이 연구에서 사용되었습니다. 리간드 및 관심 수용체는 pcDNA3.1에서 cDNA로부터 발현되었다. 깁슨 어셈블리는 neurexin3α를 pcDNA3.112에삽입하는 데 사용되었다. 노이렉신3α F/R: TTTAAACTTAAGTAGTACCTACCGAGCTCGGATCCCACCATGAGCTCTACCCTCCACTCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGTGTGTTGATATCTGCAATTCTTACAATAATAATAATAATACTCCTTGTTTCCTTTT.
  3. HEK293T 셀을 준비합니다.
    1. HEK293T 세포를 하나의 T-75 플라스크에 합류하게 성장시다.
    2. 일단 컨서블, 트립신의 2 mL을 사용하고 2 분 동안 37 ° C 인큐베이터에 배치합니다. 6mL의 HEK 미디어를 플라스크에 추가하여 세포를 재일시 중단하고 8mL를 모두 15mL ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A687T 돌연변이는 LRRTM2 7에 결합하는 Neurexin3α SS4-결합을 증가시킵니다.
두 개의 알려진 시냅스 단백질의 세포 간 상호 작용이 지적 장애 및 간질을 가진 환자에서 발견되는 포인트 돌연변이의 도입에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위해 위의 HEK 세포 집계분석(도 1)을사용했습니다. 세포는 섹션 1에 따라 전과되었고 프로토콜의 섹션 1 과 2에 따라 이미징을 준비하였다. 셀은 예상대로 집계가 관찰되지 않은 기준선에서 이미지화되었습니다(도시되지 않음). 60분에서 획득한 이미지는 프로토콜의 섹션 3과 같이 분석되었다. 선택 편향을 최소화하기 위해 실험자가 시각을 멀게 하기 위해 조건은 무작위로 생성되었습니다. 비슷한 이유로 모든 이미지의 전체 시야가 ROI로 선택되었습니다.

세포가 임의의 시냅스 리간드(GFP/mCherry)를 발현하지 않은 조건은.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 접착 중에 트랜스에서 발생하는 단백질 단백질 상호 작용을 해부하면 성숙 및 리모델링 중에 시냅스의 형성, 기능 및 유지 관리를 포함한 기본 세포 과정의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 세포 대 세포 상호 작용의 의미는 신경 생물학을 넘어 확장하고 신호 전달, 세포 이동 및 조직 발달에 있는 더 넓은 역할을14. 세포 유착의 수차는 적절한 세포 기능에 필수적인 세포 과정을 방해할 수 있으며 암, 관절염, 중독, 자폐증 및 정신 분열증1,15,16과같은 다양한 식각을 저해할 수 있다. 여기서, 우리는 트랜스에서 세포 접착 상호 작용을 테스트 할 수 있도록 HEK 세포 집계와 관련된 최적화 된 상세한 프로토콜을제공합니다.

이 HEK 세.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R00MH103531 및 R01MH1116901 에서 J.A.), 국립 일반 의학 연구소 (T32GM0007635에서 S.R.R.)의 박사 전 교육 보조금, 고급 연구를위한 리다 힐리엄 펠로우십 (GT1101.R.1)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 현미경에 도움을 케빈 울프리 박사, 그의 전형 현미경의 사용에 대한 박사 K 울리히 바이엘, 그리고 토마스 수호프 (스탠포드 대학) LRRTM2 플라스미드에 대한 도움을 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
스냅 캡이 있는 1.5mL 일회용 마이크로튜브VWR89000-028HEK 세포의 혼합 집단
배양 1000mL Rapid— 플로우 필터 장치, 0.2 um aPES 멤브레인Thermo Fisher567-0020HEK 매체 15
mL SpectraTube 원심분리기 튜브살균 Ward' s Science470224-998HEK 세포 6
웰 멸균 조직 배양 플레이트VWR100062-892HEK 세포 배양
염화칼슘시그마223506-500G인산칼슘 형질주입, HEK 세포 재현탁
원심분리기- Sorvall Legend RTKendro Laboratory 제품75004377HEK 세포
CO2 세포 인큐베이터Thermo ScientificHERACELL 150i성장 중 HEK 세포 배양
DMEM, 1x(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK 세포 유지
관리 Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 PBS (1X)Gibco14190-144계류 / 수확 HEK 세포
에틸렌 디아민 테트라 아세트산시그마ED-500G수확 HEK 세포
Falcon 배기 배양 플라스크, 75cm2< / sup> 성장 면적Corning9381M26HEK 세포 배양
소 태아 혈청시그마17L184HEK 세포 유지 보수
HEK293T 세포ATCC모델 시스템
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52p이미지 분석
염화마그네슘 육수화물시그마M9272-500GHEK 세포 재현탁
인산나트륨 이염기성 무수Fisher BioReagentsBP332-500인산칼슘 형질주입
트립신 0.25%(1X) 용액GE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK 세포
튜브 로테이터HEK 세포 혼합 집단의 배양
UltraClear 현미경 슬라이드. 화이트 프로스트, 양전하Denville Scientific Inc.M1021이미지 획득
광시야 현미경ZeissAxio Vert 200M이미지 획득
액

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. ....

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