칼슘 신호의 새로운 표적을 확인하기 위해 트랜스제닉 칼슘 리포터 Aequorin을 사용하여 유전자 화면을 전달

Deepika Mittal; Shruti Mishra; Ramgopal Prajapati; Jyothilakshmi Vadassery

doi:10.3791/61259

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방법 논문

칼슘 신호의 새로운 표적을 확인하기 위해 트랜스제닉 칼슘 리포터 Aequorin을 사용하여 유전자 화면을 전달

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DOI:

10.3791/61259

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2020년 8월 1일

Deepika Mittal¹ , Shruti Mishra¹ , Ramgopal Prajapati¹ , Jyothilakshmi Vadassery¹

¹National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

이 논문에서

요약

읽기 아웃으로 Ca^{2 +} 고도에 따라 앞으로 유전 화면은 식물에서 칼슘 의존 신호 경로에 관련된 유전 구성 요소의 식별에 이르게.

초록

앞으로 유전 스크린은 몇몇 생물학 통로에 관련되었던 유전 분대의 편견없는 식별에 있는 중요한 공구되었습니다. 화면의 기초는 관심표현형으로 스크리핑할 수 있는 돌연변이 집단을 생성하는 것이다. EMS (에틸 메탄 설포네이트)는 주어진 과정에 관련된 여러 유전자를 식별하기 위해 고전적인 전방 유전 화면에서 임의의 돌연변이를 유도하기 위한 일반적으로 사용되는 알킬팅 에이전트입니다. 세포성 칼슘(Ca²⁺⁾고도는 스트레스 지각시 활성화되는 주요 초기 신호 경로입니다. 그러나 Ca^{2 +의} 수용체, 채널, 펌프 및 수송기의 정체성은 여전히 많은 연구 시스템에서 애매합니다. Aequorin은 Aequorea 빅토리아에서 분리되고 아비도시스에서 안정적으로 발현되는 세포 칼슘 리포터 단백질입니다. 이를 악용하여, 우리는 우리가 Aequorin 형질화EMS돌연변이를 하는 전진 유전 스크린을 디자인했습니다. 돌연변이 식물로부터의 종자(M1)를 채취하고, 관심 표현형에 대한 스크리닝은 분리(M2) 집단에서 수행되었다.₁₂ 96웰의 고처리량 Ca²⁺ 측정 프로토콜을 사용하여 다양한 칼슘 반응을 가지며 실시간으로 측정되는 몇 가지 새로운 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 관심의 표현형을 가진 돌연변이는 호머지구균 돌연변이 식물 인구가 얻어질 때까지 구조되고 전파됩니다. 이 프로토콜은 Ca²⁺리포터 배경에서 유전 화면을 전달하는 방법을 제공하고 새로운 Ca²⁺규제 대상을 식별합니다.

서론

생체 내 자극또는 아바이오틱 자극의 지각시 세포칼슘(Ca2+)의 농도변화는 많은 신호경로²⁺^1,^2,^,³^3,^4를활성화시키는 잘 연구된 초기 신호이벤트이다.^, 기저 휴식 상태의 세포는 다양한 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포^5,^6로이어지는 세포 외 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포 세포에서 Ca^{2 +} 초과 Ca 2⁺ 농도를^{유지합니다.}²⁺ 신호 지각시, Ca²⁺ 수준은 세포외 및/또는 세포내 공급원으로부터 Ca^2+의 유입으로 인해 사이토솔에서 상승하고 자극 특정 칼슘 시그니처^7,^,^8,^,^9를생성한다. 시토솔의 Ca²⁺ 고도는 많은 자극에 의해 활성....