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방법 논문

칼슘 신호의 새로운 표적을 확인하기 위해 트랜스제닉 칼슘 리포터 Aequorin을 사용하여 유전자 화면을 전달

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61259

⸱

2020년 8월 1일

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

이 논문에서

요약

읽기 아웃으로 Ca2 + 고도에 따라 앞으로 유전 화면은 식물에서 칼슘 의존 신호 경로에 관련된 유전 구성 요소의 식별에 이르게.

초록

앞으로 유전 스크린은 몇몇 생물학 통로에 관련되었던 유전 분대의 편견없는 식별에 있는 중요한 공구되었습니다. 화면의 기초는 관심표현형으로 스크리핑할 수 있는 돌연변이 집단을 생성하는 것이다. EMS (에틸 메탄 설포네이트)는 주어진 과정에 관련된 여러 유전자를 식별하기 위해 고전적인 전방 유전 화면에서 임의의 돌연변이를 유도하기 위한 일반적으로 사용되는 알킬팅 에이전트입니다. 세포성 칼슘(Ca2+)고도는 스트레스 지각시 활성화되는 주요 초기 신호 경로입니다. 그러나 Ca2 +의 수용체, 채널, 펌프 및 수송기의 정체성은 여전히 많은 연구 시스템에서 애매합니다. Aequorin은 Aequorea 빅토리아에서 분리되고 아비도시스에서 안정적으로 발현되는 세포 칼슘 리포터 단백질입니다. 이를 악용하여, 우리는 우리가 Aequorin 형질화EMS돌연변이를 하는 전진 유전 스크린을 디자인했습니다. 돌연변이 식물로부터의 종자(M1)를 채취하고, 관심 표현형에 대한 스크리닝은 분리(M2) 집단에서 수행되었다.12 96웰의 고처리량 Ca2+ 측정 프로토콜을 사용하여 다양한 칼슘 반응을 가지며 실시간으로 측정되는 몇 가지 새로운 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 관심의 표현형을 가진 돌연변이는 호머지구균 돌연변이 식물 인구가 얻어질 때까지 구조되고 전파됩니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 리포터 배경에서 유전 화면을 전달하는 방법을 제공하고 새로운 Ca2+ 규제 대상을 식별합니다.

서론

생체 내 자극또는 아바이오틱 자극의 지각시 세포칼슘(Ca2+)의 농도변화는 많은 신호경로2+1,2,,33,4를활성화시키는 잘 연구된 초기 신호이벤트이다., 기저 휴식 상태의 세포는 다양한 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포5,6로이어지는 세포 외 세포 세포 세포 및 세포 외 세포 세포 세포 세포에서 Ca2 + 초과 Ca 2+ 농도를유지합니다.2+ 신호 지각시, Ca2+ 수준은 세포외 및/또는 세포내 공급원으로부터 Ca2+의 유입으로 인해 사이토솔에서 상승하고 자극 특정 칼슘 시그니처7,,8,,9를생성한다. 시토솔의 Ca2+ 고도는 많은 자극에 의해 활성화되지만, 특이성은 Ca2+,독특한 Ca2+ 시그니처 및 적절한 센서 단백질10,,11을해제하는 뚜렷한 상점에 의해 유지된다.

돌연변이 발생을 위한 알킬 메탄 설포네이트(EMS)의 사용은 공정에 관여하는 다중 독립적인 유전자를 확인하기 위한 고전적인 전방 유전 스크린의 강력한 도구입니다. EMS는 주로 C내지 T와 G를 유전체 전체에 걸쳐 무작위로 전환하도록 유도하는 화학 돌연변이원이며 게놈의 125kb마다 1bp 변화를 일으킵니다. EMS 돌연변이 발생은 게놈12당삽입/삭제(InDel) 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 유도하여 1000개의 단일 염기 쌍 변화를 유도한다. EMS 유도 돌연변이는 궤적 당 1/300에서 1/300000에 이르는 돌연변이 주파수를 가진 다중 점 돌연변이입니다. 이것은 주어진 유전자에 있는 돌연변이를 찾아는 데 필요한 M1 식물의 수를 감소시킵니다. 2000-3000의 M1 종자 인구 범위는 전형적으로 아라비도시스 탈리아나,13,14에대한 관심의 돌연변이를 얻기 위해 사용된다.

Aequorin 형질전환은 사이토솔15에서p35S-아포아에쿠린(pMAQ2)을 발현하는 아라비도시스 컬럼비아-0(Col-0) 에코타입 식물이다. Aequorin은 혈관 단백질및 루시페린 분자, coelenterazine로 구성된 보철군으로 구성된 Ca2+ 결합 단백질입니다. Ca2+의 결합은 3개의 Ca2+ 결합 EF 손 부위를 가지고 있으며, 코엘엔테아진은 산화되고 분화되어 디옥세타네 중간체를 제공하고, 이산화탄소와 단일 흥분 코엘엔테아미드16의방출과 함께 단백질의 형성적 변화가 뒤따릅니다. 생성된 코엘엔테아미드는광미계(17)에의해 검출될 수 있는 청색광(λmax,470 nm)을 방출한다. 매우 빠른 Ca2+ 고도는 따라서 실시간으로 측정될 수 있고, 급속한 전진 유전 스크린을 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 서명에 관련된 새로운 주요 플레이어를 식별하기 위해 칼슘 반응의 특이성을 사용하는 것을 목표로 합니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 형질 전환 aequorin에서 EMS 돌연변이 발생을 사용하고 변경 된 Ca2 + 신호와 관련된 SNP를 식별합니다. 이 프로토콜은 각성부리 추가 시 Ca2+ 고도가 감소하지 않거나 감소된 돌연변이를 식별합니다. 이러한 돌연변이는 Ca2+ 반응을 담당하는 유전자를 식별하기 위해 매핑될 수 있습니다. 이 방법은 Ca2+ 고도를 초래하는 식물의 모든 종류의 액체 자극에 적용됩니다. Ca2+ 고도는 식물 방어 신호 경로의 첫 번째 응답 중 하나이므로 업스트림 응답 구성 요소의 식별은 유전 공학후보자에게 탄력성 식물을 개발할 수 있는 후보자를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

1. EMS 돌연변이 발생 및 단일 혈통 기반 종자 수집 (1-3 개월)

  1. EMS 돌연변이 발생 (M0 씨앗)에 대한 aequorin의 씨앗 (~7500)의 150 mg의 씨앗을 무게. 또 다른 무게 150 컨트롤로 사용할 씨앗의 mg.
  2. 씨앗을 50mL 튜브로 옮기고 0.2% EMS(v/v) (주의) (치료용) 또는 25mL의 오토클레이브 워터(제어용)를 추가한다.
    참고: 에틸 메탄 설포네이트는 식물 물질을 돌연변이시키는 화학 물질입니다.
  3. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 알루미늄 호일로 감쌉니다. 실온에서 18시간 동안 튜브 엔드 오버 엔드를 회전시합니다.
  4. 씨앗이 정착하도록 허용합니다. EMS 솔루션을 신중하게 제거하고 동일한 볼륨으로 1 M NaOH가 들어있는 폐기물 용기에 폐기하십시오(NaOH는 EMS를 중화/비활성화하여 폐기할 수 있습니다). 1M NaOH 용액에서 사용된 플라스틱을 폐기하십시오.
    참고: 24시간 이후에는 유해 물질 실험실 관행에 따라 폐기를 폐기하십시오.
  5. 돌연변이 된 씨앗을 40 mL의 자동 용수로 8 번 이상 철저히 씻으십시오. 위에서 언급한 대로 NaOH 폐기물 용기에 물이 들어 있는 EMS를 폐기하십시오.
  6. 최종 세척을 위해, 100mM 나트륨 티오술파테의 40mL를 추가하고 EMS의 흔적을 제거하기 위해 3번 헹구는다.
  7. 씨앗을 40mL의 오토클레이브 워터에 넣고 ~1h의 씨앗을 담그고 EMS를 씨앗에서 확산한 다음 완전히 건조할 때까지 필터 용지에 놓습니다.
  8. 씨앗을 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고 2-4일 동안 40mL의 오토클레이브 수에서 4°C에서 씨앗을 계층화한다. 이것은 종자 휴면성을 깨는 데 도움이 되며 균일한 성장을 보장합니다.
  9. 돌연변이 된 씨앗 (M0)과토양에 제어 씨앗을 모두 전송 (토양 조성 : 토양 : 토양, 1:1) 16 h 빛 / 8 h 어두운 광기간, 150 μmol m의 빛 강도와 성장 실로 전송$2∙-1및 ~70% 상대 습도.
  10. 돌연변이 발생이 성공했는지 확인하려면 발아 속도와 모종 성장 감소, 엽록소 섹터18(그림 1A)을찾습니다. 돌연변이 식물을 대조식물과 비교하여 이러한 생리적 및 발달 적 차이를 식별합니다.
    참고 : 다른 방법은M1 식물에서 씨앗을 수확하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 단일 가계도 기반 시드 수집 방법을 사용했습니다. 각M1 플랜트에는 A1부터 A3500까지 고유한 번호가 부여됩니다.
  11. 개별 적으로 번호가 매겨진 식물을 개별 식물라인(그림 1B)으로유지합니다.
  12. 성숙시, 이러한 개별 돌연변이 식물에서 씨앗을 수확하고 개별 M1 라인(그림 2)으로저장합니다. 단일 가계 기반 시드 컬렉션에서 3,500 M1 라인을 상영한 약 5000 M1 라인을 획득했습니다.

2. 돌연변이를 선택하는 높은 처리량 스크리닝 (8 개월)

  1. 선택한 자극에 대한 Ca2+ 응답을 기반으로 새 돌연변이를 식별합니다. 여기서는 H2 O2를예로 들 수 있습니다.
  2. 돌연변이를 식별하기 위해 M2 세대를 화면으로 확인합니다. EMS 돌연변이 발생14에따라 M2 세대에서 1/8 주파수에서 열회 돌연변이체 분리되기 때문에 8-12 M2-분리식물의 검사는 하나의 M1 라인을 커버하고 호름구스 오목 돌연변이를 식별합니다 (12 묘목을 사용하여 돌연변이를 발견 할 확률을 증가시킵니다). 각 독립 M1 라인에서, 테스트 12 M2 묘목 에 대한 Ca2 + H2O2 (M1 라인 당 12 M2 묘목)에 대한 응답.
  3. 높은 처리량 종자 살균 및 수경 식물 성장프로토콜(19)을사용한다. M1라인당 거의 12-15M2 씨앗을 24웰 의 조직 배양 판의 개별 우물에 놓고 염소 가스(40mL의 12% 나트륨 하이염소산 및 염산, 3:1, v/v)를 연기 후드에 4시간 동안 건조기에서 사용한다. 시술 후, 건조기를 열고 염소 가스가 증발할 수 있도록 하룻밤을 둡니다.
  4. 살균 후, 접시를 외부에 가져와 서 액체 1/2 MS 미디어 (한천없이 반 강도 MS)를 개별 우물에 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 2-4일 동안 씨앗을 계층화한 다음, 70%의 상대 습도로 20-22°C에서 10h 빛/14h 다크 포토기간으로 씨앗을 성장 챔버로 이동시한다.
  5. 모종은 8-12 일 된 후 각 라인에서 개별적으로 12 M2 묘목을 96 웰 광미미터 플레이트에 배치하십시오. H 2O2에대한 Ca2+ 응답을 측정하려면 윤미계 플레이트 판독기를 사용하십시오.
  6. 모종 전달 후, 5-10 μM coelentrazine 용액의 150 μL을 추가 (메탄올의 5mM 재고에서 오토 클레이브 물에 희석) (주의) 어두운 / 낮은 조명 영역에서 개별 우물에 8 시간 동안 21 ° C에 어두운에 저장.
    참고: Coelentrazine는 아포-아쿠오린에 결합하 고 기능적인 aequorin에 그것을 재구성 하는 보철 그룹. Coelentrazine는 빛에 민감하고 따라서 빛으로부터 보호 어두운 색의 병에 저장됩니다.
  7. 다음 날, 자극으로 10mM H2O2를 사용하여 돌연변이 화면을 수행하고 후속 Ca2+ 응답을 측정합니다.
  8. 24개의 우물동시 측정을 위해 1분 동안 배경을 측정하는 자동 운동 프로그램을 만들고, 자극 첨가(40 μL) 및 측정이 10분 동안, 총 aequorin 방전(150 μL 20% 에탄올2 2M)을 1-2분 동안 생성합니다.
    참고: 측정된 Ca2+를 정량화하고 기능성 aequorin에 대한 추가 제어로 총 aequorin에 대한 최종 방전이 필요합니다. 최종 방전은 1-2분의 짧은 실행이며 상당한 식물 사망을 일으키지 않습니다. 또는, 방전 단계 후에 식물이 정지하는 경우에, 그 후에 특정 M1 선을 다시 스크린하고 방전 없이 구조합니다. 이러한 돌연변이는 방전 단계를 사용하여 M3 및 M4 세대에서 확인할 수 있다.
  9. 측정 점당 웰당 300ms 통합 시간으로 7s 간격으로 각 행을 측정하는 24웰 포맷 스캐닝 방법을 사용합니다. 돌연변이의 비교 및 평가를 위해 각 행의 컨트롤로 야생 형 모종을 사용합니다.
    참고:M2 묘목을 포함하는 단일 96 웰 플레이트는 8 개의 개별 M1 라인 (8 M1* 12 = 96 M2)을커버하며 2.5 h로 스크리닝 할 수 있으며 매일 32 M1 라인을 스캔할 수 있으며 매월 640 M1 식물을 선별할 수 있습니다. 식물이 준비된 후 전체 선별 절차는 약 8개월이 소요됩니다.
  10. H 2O2로Ca2+ 응답의 손실 또는 감소에 따라 돌연변이를 식별합니다. 항생제 기반 세척 과정을 통해 선택한 돌연변이를 구출하십시오. 25 mg / L cefotaxime 용액으로 묘목을 두 번 씻은 다음 1/2 MS agar에 25 mg / L cefotaxime를 포함하는 구조 매체로 옮겨.
  11. 10h 빛/ 14h 어두운 광기간에 플레이트를 성장하여 돌연변이 식물을 얻습니다. 세포택시 세척은 모종에 유해한 미생물을 제거하는 데 도움이됩니다. 재구성 후 묘목은 밀봉되지 않은 상태로 유지되므로 멸균 상태로 다시 이송할 때 오염을 최소화하십시오.
  12. 돌연변이 식물을 토양으로 이송하여 동종구스 M3 인구를 획득한다.

3. 데이터 분석 및 돌연변이 식별 (1-3 개월)

참고: 위의 방법에서 제공된 판독값은 상대 광 단위(RLU)에 있습니다.

  1. [Ca2+]시트 농도를 계산하기 위해 다음 농도방정식(20)을사용한다.
    pCa = 0.332588 (-로그 (L / L최대))+ 5.5593
    발광 카운트 () 및 총 남은 카운트(최대).
  2. 얻어진 pCa 값을 μM의 [Ca2+]시트 값으로 변환하여 106으로곱합니다. 그런 다음 ca2+ 응답에 푸티징 H2O2 돌연변이를 식별하기 위한 aequorin(트랜스제닉 Col-0 aequorin) 제어에 대해 그래픽으로 플롯합니다.
  3. 구조된 H2 O2애플리케이션에 대한2 응답이 손실또는 감소된 것을 보여주는 구조 묘목.
  4. 성숙시, 구조된 돌연변이체에서 씨앗을 수확하고 M3 묘목에서 H 2 O2에대한 응답을 다시 화면으로 재검사합니다.2 모든 12 M3 묘목이 모성 식물과 유사한 Ca2 + 응답을 표시하는 경우, 동종 M3 돌연변이 인구로 인구를 고려. 모든 12 묘목이 이러한 반응을 표시하지 않는 경우, 다음 M4 세대로 가져 가서 동종 모집단 인구를 얻기 위해 다시 화면.
  5. 일단 동질식물선이 얻어지면, 차세대 시퀀싱을 사용하여 변한 표현형으로 이어지는 유전자를 식별한다.

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결과

EMS 인구는 H 2 O2 유도 Ca2+고도에 대해 선별되었습니다.2+ 앞서 설명한 바와 같이, 각M1 라인에서 12개의 개별M2 묘목을 선별했습니다. 도 3에서이러한 M1 라인은 12개의 개별 M2 묘목을 보여주는 각 패널로 플롯됩니다. 야생형 aequorin은 돌연변이 반응을 비교하고 평가하기 위한 컨트롤로 사용됩니다. 1:7(돌연변이: 비 돌연변이)의 비율로 오목돌연변이 분리. M1 라인당 12개의 개별 묘목을 검사할 때, 우리는 라인당 1개 또는 2개의 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 우리는 12 M2 묘목(그림 3)에서2 개의 퍼팅 돌연변이를 확인했습니다. 이러한 돌연변이는 M3 및 M4로 더 이동하고...

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토론

EMS 돌연변이 발생은 인구에서 돌연변이를 생성하는 강력한 도구입니다. EMS를 사용하는 고전적인 미래 유전 화면은 두 가지 주요 이유로 새로운 유전자를 식별하는 효과적인 도구였습니다 : 첫째로, 유전자 정체성에 대한 사전 가정을 필요로하지 않으며 둘째, 편견을 소개하지 않습니다. EMS, T-DNA 삽입, 방사선 등과 같은 선별 인구를 생성하는 몇 가지 방법이 있습니다. 모든 방법 중 EMS 기반 돌연변이 발생은 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 현재프로토콜(21)및22에기재된 바와 같이 EMS에 노출시킴으로써 돌연변이 집단을 생성하는 것이 더 용이하다. 둘째, 돌연변이 종자 모집단의 충분히 많은 수를 생성할 수 있으며, 이는 하나 이상의 자극에 대해 여러 화면에 사용될 수 있다. 셋째, 잘못된 돌연변이로 인해 생성된 필수 유전자의 약한 진상계가 확인될 수 있다. 넷째, 완전한 기능 상실, 부분 기능 상실...

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공개 사항

어떤 저자도 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

국립 식물게놈 연구 연구소 - 식물 성장을 위한 식물성 자, 비디오 촬영을 위한 봄베이 로케일, e-리소스에 대한 접근성을 제공하는 생명공학-eLibrary 컨소시엄에 감사드립니다. 이 작품은 국립 식물 게놈 연구 코어 그랜트, 막스 플랑크 Gesellschaft-인도 파트너 그룹 프로그램을 통해 생명 공학부, 인도의 부에 의해 지원되었다; CSIR-주니어 연구 펠로우십(D.M 및 S.M) 및 생명공학-주니어 연구 펠로우십(R.P).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
묘목 성장을위한24 웰 조직 배양 플레이트Jetbiofil11024
96 웰 화이트 cliniplate발광계 측정을위한Thermo Scientific9502887
Aequorin
AgropetLab Chem India
염화칼슘Fisher Scientific12135 용액
CoelenterazinePJK55779-48-1보철족 에
에틸메탄 설포네이시그마 AldrichM0880-5G종자 돌연변이 유발
에탄올방전 용액시약1170
염산Merck Life Sciences1.93001.0521멸균 용액
과산화수소Fisher Scientific15465칼슘 상승
Luminoskan 상승Thermo Scientific5300172aequorin 발광 측정
MES 버퍼HimediaRM1128-100G식물 성장
Murashige 및 skoog 미디어Himedia PT021-25L식물 성장
수산화나트륨Fisher Scientific27805EMS 중화용
차아염소산나트륨Merck Life Sciences1.93607.5021멸균 용액
오황산나트륨FisherScientific 280051.6단계에서 종자 세척용
soilriteLab Chem India식물 성장을 위한
Square potsLab Chem India식물 성장을 위한
Sigma AldrichS0389식물 성장
TaximAlkem묘목 구조를 위한
식물 성장을위한 배출 용트 분석 자극 티 7180720

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