방법 논문

뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜

DOI:

10.3791/61262

⸱

2020년 7월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

이 논문에서

요약

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Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 비용 효율적인 방식으로 생산되며 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. BDNFavi는 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니화된다. BDNFavi 및 모노 바이오타이니드 BDNFavi는 시판되는 BDNF와 비교하여 생물학적 활성을 유지합니다.

초록

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Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화 성염색체에 의해 비용 효율적으로 정제된다. 재현 가능한 프로토콜은 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니레이트 BDNFAvi를 개발하였다. 이 반응에서, 모노 바이오티니화 BDNFAvi는 그것의 생물학 활동을 유지합니다.

Neurotrophins는 신경 발달 및 유지 보수에 있는 역할을 하는 표적 유래 성장 인자입니다. 그(것)들은 다른 신경 구획 사이 장거리 신호화를 허용하기 위하여 내분비 통로를 따라 급속한 수송 기계장치가 필요합니다. neurotrophins의 인신 매매를 연구하는 분자 공구의 발달은 생체 내 기록을 사용하여 세포에 있는 이 단백질의 정확한 추적을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜에서는 모노 바이오타이니드 BDNF 생산을 위한 최적화되고 비용 효율적인 절차를 개발했습니다. 생체개능 avi 서열(BDNFAvi)을 함유한 재조합 BDNF 변종은 마이크로그램 범위의 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 확장 가능한 절차로 정제된다. 정제된 BDNF는 튜브내 효소 BirA와의 직접 체외 반응에 의해 균일하게 모노 바이오티니화될 수 있다. 모노 바이오타이니드 BDNF(mbtBDNF)의 생물학적 활성은 상이한 형광에 대한 연쇄상 구각에 공인될 수 있다. BDNFAvi 및 mbtBDNF는 각각 서부 얼룩을 사용하여 하류 인광 표적의 검출및 전사 인자 CREB의 활성화를 통해 입증된 생물학적 활성을 유지한다. 스트렙타비딘 양자점을 사용하여, 우리는 인계 CREB 특정 항체로 검출된 CREB의 활성화와 수반되는 mbtBDNF 내재화를 시각화할 수 있었습니다. 또한, mbtBDNF는 연쇄상 구균-양자점에 공주하여 미세유체 챔버에서 자란 피질 뉴런의 역행 운송 분석에 적합했다. 따라서, 튜브에서 생성된 mbtBDNF는 뉴런에서 생리적 신호 내역및 인신매매를 연구하는 신뢰할 수 있는 도구이다.

서론

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뉴런은 시냅스 통신을 허용하는 복잡하고 전문적인 형태를 소유하는 신경계의 기능 단위이며, 따라서 다양한 자극에 대응하여 조정되고 복잡한 행동의 생성이다. 점선 및 축삭과 같은 신경 투영은 신경 통신에 관여하는 중요한 구조적 특징이며, neurotrophins는 그들의 형태와 기능1을결정하는 결정적인 선수입니다. Neurotrophins는 NGF, NT-3, NT-4 및 두뇌 유래 신경 영양인자 (BDNF)2를포함하는 분비성장 인자의 가족입니다. 중추신경계(CNS)에서 BDNF는 신경전달, 수지상 식소, 수지상 척추의 성숙, 장기 전능성 등 다양한 생물학적 과정에 참여한다3,,4. 따라서, BDNF는 신경 기능을 조절에 중요한 역할을 한다.

다양한 세포 프로세스는 BDNF 역학 및 기능을 조절합니다. 신경 표면에, BDNF는 tropomyosin 수용체 키나아제 B (TrkB) 및/또는 p75 neurotrophin 수용체 (p75)를 결합합니다. BDNF-TrkB 및 BDNF-p75 복합체는 내분비소로 분류되어 다른 내세포 세포기관

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프로토콜

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모든 실험은 CONICYT (칠레 과학 기술 연구위원회)의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 사용된 프로토콜은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 보안 및 생물 윤리 및 동물 복지 위원회에 의해 승인되었습니다. 척추 동물과 관련된 실험은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 윤리 및 동물 복지위원회에 의해 승인되었습니다.

참고: 다음 프로토콜은 HEK293 세포에서 생산된 조건부 배지의 총 부피 500mL로부터 BDNFAvi를 정화하도록 설계되었습니다. BDNFAvi를 정화하기 위해 생산 및 처리되는 조건부 매체의 양은 필요에 따라 위 또는 축소될 수 있습니다. 그러나 이러한 상황에서는 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 전체에 사용되는 배양 매체 및 버퍼의 구성은 보충 재료에서 찾을 수 있습니다.

1. HEK293 컨디셔닝 된 미디어에서 BDNFAvi의 생산 및 정화

  1. HEK293 세포의 트랜스페트
    1. HEK293 세포를 37 ºC에서 15cm 배양 요리로 보충DMEM 배지(소 태아 혈청 10%, 글루타민1배보충제, 항생제/항마이코틱)에서 70%로 성장시다.
    2. 매체를 트랜스페션 버퍼로 변경합니다.

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결과

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크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜을 사용하면 상당한 양의 HEK293 조건부 미디어를 처리할 수 있습니다. 도 1에서,조건부 미디어의 500mL로부터 BDNFAvi의 정제 결과를 도시한다. Ni-NTA 아가로즈 구슬로부터 BDNFAvi의 연속 출례는 BDNFAvi의 농도감소(도 1A)를산출한다. 4회 연속 출루(각 15분 간) 구슬에 의해 포착된 BDNF의 대부분이 회복됩니다. 용출물의 농도는 6 내지 28 ng/μL범위이며, 총 수율은 BDNFAvi(표1)의약 60μg에 달한다. 생성된 BDNFAvi는 그 때 비생물화BDNFAvi의 부재에 의해 입증된 바와 같이 BirA-GST에 의해 중재된 체외 반응에 의해 효율적으로 생체화되었다(도1B). 도 1B에 제시된 생체세니클.......

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토론

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본 문서에서는, 친화도 크로마토그래피 기반 절차에서 mbtBDNF의 생산 및 정화를 위한 최적화된 방법론이 기술되고, 성 및협력자(17)의작업을 기반으로 한다. 최적화는 리포펙타민과 같은 더 비싼 형질 전환 방법의 효율성을 유지하면서 비용 효율적인 트랜스페트 시약 (PEI)의 사용을 포함한다. 이러한 최적화는 프로토콜의 상당한 비용 절감으로 이어지며 높은 비용 효율성을 유지하면서 확장성을 제공합니다. 또한 이 프로토콜에는 최대 2개월 동안 조건부 용지를 동결하는 등 사용 편의성 고려 사항이 포함되어 있습니다. 이러한 최적화는 각 실험실의 요구에 맞게 절차를 조정하고, 비용 효율성을 개선하며, 균일하고 생물학적으로 활동적인 재조합 BDNF를 산출합니다. 프로토콜은 또한 크로마토그래피 장치의 사용을 원추형 튜브내구슬의 중력 강수량으로 대체함으로써 소규모 생산에 적응할 수 있다. 이는 실행 가능한 방법론을 구성하지만 시간이 덜 효율적이며 경험에서 수익률이 낮아졌습니다. 비오틴 라벨BDNF는 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 폰데시트 (1171137) (FCB), 과학 기술 우수 센터 (AFB 170005) (FCB), 밀레니엄 핵 (P07/011-F) (FCB), 웰컴 트러스트 수석 조사상 (107116/ Z/Z/ 15) 영국 연구소(107116/Z/Z)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다. 이 작품은 Unidad 드 마이크로스코피아 아반자다 UC (UMA UC)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2 방향 스톱콕BioRad7328102크로마토 그래피 장치 구성 요소
2- 메르 캅토 에탄올시그마M6250BDNF 용출 완충액
아크릴 아미드 / 비사 크릴 아미드BioRad 1610154SDS-PAGE 겔 준비
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF 농도
암모늄 퍼 설페이트시그마A9164SDS-PAGE 겔 제제
안티 B-III-Tubulin 항체시그마T8578BDNF 생물 활성 검출 용 웨스턴 블롯 분석
안티 BDNF 항체AlomoneAGP-021BDNF 정량화를위한 웨스턴 블롯 분석
안티 BDNF 항체AlomoneANT-010BDNF 정량화를위한 웨스턴 블롯 분석
안티 ERK 항체세포 신호9102BDNF 생체 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석
안티 pCREB 항체 (S133)세포 신호9198BDNF 생물학적 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석
안티 pERK 항체 (T202, Y204)세포 신호4370BDNF 생물 활성 검출 안티 pTrkB 항체를 위한 웨스턴 블롯 분석
(Y515)Abcamab109684BDNF 생물학적 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석
항생제/항진균제Gibco15240-062HEK293 유지 관리
ATPSigmaA26209BDNF 모노비오틴화 완충액
B-27 보충제Gibco17504-044뉴런 유지 Bicine
SigmaB3876BDNF 모노비오틴화 완충액
BirA-GSTBPS Bioscience70031BDNF AviTag 모노비오틴화
소 태아 혈청HyCloneHC용 효소. SH30396.02HEK293 유지 관리
소 혈청 알부민Jackson ImmunoResearch001-000-162BDNF 완충액 변형 성분, 웨스턴 블롯 및 면역 형광에 대한 차단 완충액
D-BiotinSigmaB4639BDNF 모노비오틴화 완충액
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 유지보수
Econo Column FunnelBioRad7310003크로마토그래피 장치 구성 요소
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Western blotting에 의한 단백질 검출
GlutamaxGibco35050-061Neuron 및 HEK293 유지보수
GlycerolMerck104094BDNF 용출 완충액, 웨스턴 블롯 분석용 용해 완충액
Hettich Rotina 46R 원심분리기Hettich단종파편 매체 제거에 사용되는 원심분리기
Hettich Universal 32R 원심분리기Hettich단종원심분리기 단백질 농축기 원심분리에 사용되는 단
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063웨스턴 블롯 이미지 획득
ImidazoleSigmaI55513BDNF 버퍼 변형 구성 요소
KClWinklerBM-1370PBS 구성 요소
KH2PO4Merck104873PBS 구성 요소
LamininInvitrogen23017-015구획화된 뉴런용 커버 코팅
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245크로마토그래피 장치 구성 요소
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904면역형광 분석용 마운팅 시약
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001비오틴화(Biotinylation) 검증
Na2HPO4</sub>Merck106586BDNF 완충액 변형 성분
NaClWinklerBM-1630PBS 성분, BDNF 완충액 변형 성분
NaH2PO4Merck106346BDNF 완충액 변형 성분
Neurobasal MediumGibco21103-049뉴런 유지 보수
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag 정제
Nikon Ti2-E형광 이미징용Nikon
니트로셀룰로오스 멤브레인BioRad1620115웨스턴 블로팅용 단백질 전달
ORCA-Flash4.0 V3 디지털 CMOS 카메라HamamatsuC13440-20CUepifluorescence imaging 용 카메라
P8340 프로테아제 억제제 칵테일시그마P8340BDNF 완충액 변형 구성
요소 파라 포름 알데히드Merck104005면역 형광 분석 용 고정제
Penicillin / StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating 구획화된 뉴런용
Poli-L-LysineMilliporeP2363비구획화된 뉴런용 커버 코팅
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼BioRad7311550크로마토그래피 장치 구성 요소
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 트랜스펙션
양자 점 655 스트렙타비딘 접합체InvitrogenQ10121MP생체 및 고정 세포 실험용 모노비오틴화 BDNF AviTag 라벨
SaponinSigmaS4521면역형광 분석용 세제
184 실리콘 엘라스토머 베이스Poirot4019862미세유체 챔버 준비
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE 겔 제제
TrisWinklerBM-2000용해 완충액 성분
Triton X100Merck108603면역형광 및 웨스턴 블롯 분석에서 세포 투과화
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 계승
종 원심분리기 현미경: Syldgard

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology.

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BDNFBDNFHEK293BirA

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