경로 협회 연구 도구 (과거)를 실행 하 여, 빛나는 응용 프로그램을 통해 또는 R 콘솔을 통해, 연구원은 그들의 게놈 전체 협회 연구의 생물학적 의미의 깊은 이해를 얻을 수 있습니다 (GWAS) 관련 된 신진 대사 경로 조사 하 여 결과.
방법 논문
경로 협회 연구 도구 (과거)를 실행 하 여, 빛나는 응용 프로그램을 통해 또는 R 콘솔을 통해, 연구원은 그들의 게놈 전체 협회 연구의 생물학적 의미의 깊은 이해를 얻을 수 있습니다 (GWAS) 관련 된 신진 대사 경로 조사 하 여 결과.
최근에는 대사경로 분석을 이용한 게놈 전체 협회 연구(GWAS) 데이터를 해석하기 위한 이전에 설명된 방법의 새로운 구현이 개발및 발표되고 있다. 경로 협회 연구 도구(PAST)는 사용자 친화성 및 느린 실행 분석으로 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 사용자 친화적 인 도구는 바이오 컨덕터 및 Github에 출시되었습니다. 테스트에서 PAST는 이전에 24시간 이상 필요한 1시간 이내에 분석을 실행했습니다. 이 문서에서는 Shiny 응용 프로그램 또는 R 콘솔을 사용하여 PAST를 실행하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 복잡한 특성과 그들과 관련된 게놈영역을연구하는 인기 있는 방법이다1,2,3. 연구의 이 모형에서, 단 수십만개의 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마커는 특성과의 그들의 협회를 위해 시험되고, 협회의 중요성을 평가됩니다. 잘못된 발견률(FDR) 임계값(또는 다른 유형의 유의 임계값)을 충족하는 마커-특성 협회는 연구를 위해 유지되지만 진정한 연관성은 필터링될 수 있습니다. 복잡하고 다원성 특성의 경우, 각 유전자의 효과는 작을 수 있으며(따라서 여과됨), 일부 진상항제는 연구3에존재하지 않을 수 있는 특정 조건에서만 발현된다. 따라서, 많은 SMP가 특성과 연관된 바와 같이 유지될 수 있지만, 각각은 매우 작은 효과를 가질 수 있다. 너무 많은 SNP 호출이 누락될 것이며, 특성의 생물학적 의미와 유전 적 구조에 대한 해석은 불완전하고 혼란 스러울 수 있습니다. 대사 경로 분석은 그들의 생물학적 기능에 따라 그룹화 된 유전자의 결합 된 효과에 초점을 맞추어 이러한 문제 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다4,5,6.
이 문서에서 설명한 메서드의 이전 구현을 사용하여 여러 연구가 완료되었습니다. 아플라톡신 축적7,옥수수 귀벌레 저항8,및 오일 생합성9는 모두 이전 구현과 함께 연구되었다. 이러한 분석은 성공적이었지만 분석 도구가 R, Perl 및 Bash의 조합으로 작성되었으며 파이프라인이 자동화되지 않았기 때문에 분석 프로세스가 복잡하고 시간이 많이 걸리며 번거로울 수 있었습니다. 각 분석에 대해 이 방법을 수정하는 데 필요한 전문 지식으로 인해 다른 연구원과 공유할 수 있는 새로운 방법이 개발되었습니다.
경로 협회 연구 도구(PAST)10은 프로그래밍 언어에 대한 지식이 적고 짧은 기간에 분석을 실행하여 이전 방법의 단점을 해결하도록 설계되었습니다. 이 방법은 옥수수로 테스트되었지만 PAST는 종별 가정을 하지 않습니다. 과거는 샤이니 앱으로 R 콘솔을 통해 실행할 수 있으며, 온라인 버전은 곧 MaizeGDB에서 사용할 수 있을 것으로 예상됩니다.
1. 설정
2. 샤이니 분석 사용자 지정 (선택 사항)

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3. 로드 GWAS 데이터
참고: GWAS 데이터가 탭 구분이 없는지 확인합니다. 연결 파일에 특성, 마커 이름, 궤적 또는 염색체, 염색체의 위치, p 값 및 마커의 R2 값과 같은 열이 포함되어 있는지 확인합니다. 효과 파일에 특성, 마커 이름, 궤적 또는 염색체, 염색체 위치 및 효과와 같은 열이 포함되어 있는지 확인합니다. 사용자가 데이터를 로드할 때 열이름을 지정할 수 있기 때문에 이러한 열의 순서는 중요하지 않습니다. 추가 열은 무시됩니다. TASSEL13은 이러한 파일을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

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4. 로드 연결 분리 (LD) 데이터
참고: 연결 분산(LD) 데이터가 탭 구분되어 있는지 확인하고 다음과 같은 유형의 데이터가 포함되어 있는지 확인합니다: 로커스, Position1, Site1, Position2, Site2, Position1과 Position2 사이의 기본 쌍의 거리 및 R2 값.

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5. 유전자에 SNP를 할당
참고: GFF 형식으로 주석을 다운로드하거나 찾습니다. 이 주석은 종종 특정 유기체에 대한 온라인 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다. 주석 데이터의 품질이 경로 분석의 품질에 영향을 미치기 때문에 품질이 낮은 주석에 주의하십시오. 이러한 주석의 첫 번째 열(염색체)이 협회, 효과 및 LD 데이터에서 궤색/염색체의 형식과 일치하는지 확인합니다. 예를 들어 GWAS 및 LD 데이터 파일이 첫 번째 염색체 "1"을 호출하는 경우 주석은 첫 번째 염색체 "chr1"을 호출해서는 안됩니다.

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6. 중요한 경로를 발견하십시오.
참고: 경로 파일에 탭 구분 형식의 다음 데이터가 포함되는지 확인하며, 각 경로의 모든 유전자에 대해 한 줄씩 포함되는지 확인합니다: 통로 ID - "PWY-6475-1"과 같은 식별자; 통로 설명 - 통로가 "트랜스 리코펜 생합성"과 같은 무엇을하는지에 대한 긴 설명; 유전자 - 주석에 제공된 이름과 일치해야 하는 통로의 유전자입니다. 경로 정보는 MaizeGDB와 같은 특정 유기체에 대한 온라인 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다. 두 번째 사용자 지정 옵션은 모드입니다. "증가"는 수율과 같이 측정된 특성의 증가값이 바람직할 때 를 반영하는 표현형을 지칭하며, "감소"는 곤충 손상 등급과 같이 측정값의 감소가 유익한 특성을 의미한다. 경로의 중요성은 이전에 설명된 방법4,6,14를사용하여 테스트된다.

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참고: 과거 샤이니 분석(2.2단계)의 시작 부분에 설정된 코어 수와 모드가 이 단계에서 사용됩니다. 유전자의 기본 수는 현재 5개의 유전자에서 설정됩니다, 그래서 더 적은 알려진 유전자를 가진 통로는 제거될 것입니다. 사용자는 이 값을 4 또는 3으로 낮출 수 있으며, 더 짧은 경로를 포함할 수 있지만 그렇게 하면 거짓 긍정 결과가 발생할 수 있습니다. 이 값을 늘리면 분석의 힘이 증가할 수 있지만 분석에서 더 많은 경로를 제거할 수 있습니다. 사용되는 순열 수를 변경하면 테스트의 힘이 증가하고 감소합니다.
7. 러그플롯 보기

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PAST 소프트웨어 도구 실행 후 결과가 생성되지 않은 경우 모든 입력 파일의 형식이 올바르게 지정되었는지 확인합니다. 곡색의 옥수수 GWAS를 기반으로 하는 PAST 패키지의 예제 데이터를 사용한 성공적인 실행은 그림 8에나와 있다. 이 테이블과 결과 이미지는 결과 다운로드 버튼을 사용하여 다운로드할 수 있습니다. 다운로드한 이미지의 예는 도 210에표시됩니다. 잘못된 설정은 생물학적 의미가없는 결과로 이어질 수 있지만 부정확성을 결정하는 것은 선택한 설정의 유효성을 다시 확인하고 관심의 특성에 관한 알려진 모든 증거를 고려해야하는 연구원에게 달려 있어야합니다.
도 910은 곡물 색에 대한 표현형이었던 288개의 근친선의 옥수수 패널로 생성된 GWAS 결과의 경로 분석에서 생성된 러그플롯을 나타낸다. 표현형이 "흰색" 또는 "노란색"이었던 이 단순한 예는 밝은 노란색 카로티노이드 안료를 만드는 통로가 알려져 있고 대부분의 표현형에 대한 책임이 있기 때문에 사용되었습니다. 따라서, 우리는 트랜스 리코펜 생합성 경로 (카로티노이드를 생산하는)가 곡물 색상과 현저하게 연관될 것으로 예상했습니다. 경로 ID와 이름은 그래프 상단에 나열됩니다. 그래프의 수평 축은 특성에 가장 큰 영향을 미치는 순서로 왼쪽에서 오른쪽으로 배열된 분석에 포함된 모든 유전자를 가장 작은 특성으로 평가합니다. 그러나, 트랜스 리코펜 생합성 경로에 있는 유전자만 표시된다 (그래프의 상단에, 해치 마크로, 분석에 있는 다른 모든 유전자에 비해 그들의 효과의 유전자 순위에 나타나는). 이 통로에 있는 7개의 유전자가 있습니다. 실행 보강 점수(ES)는 세로 축을 따라 플롯됩니다. 각 유전자에 대한 ES는 실행 합계로 추가되어 효과순으로, 총은 분석된 유전자의 수에 따라 조정된다. 따라서, 점수는 수평축을 따라 오른쪽으로 이동하여 더 큰 효과 유전자가 포함됨에 따라 증가하는 경향이 있지만, 어느 시점에서, 효과의 증가는 다른 유전자를 첨가한 조정보다 작으며, 전체 점수는 감소하기 시작한다. 실행 중인 ES 선의 정점은 점선세로 표시됩니다. 이것은 전체 경로에 대한 ES이며 경로가 선택되고 rugplot로 제시되는지 여부를 결정하는 프로그램에 의해 사용됩니다.

그림 8: 과거 샤이니의 완료 실행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 과거 (또는 샤이니에서 다운로드)의 완료 된 실행에서 경로 이미지. 이 수치는 Thrash 외10에서인용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PAST의 주요 목표는 GWAS 데이터의 신진 대사 경로 분석을 더 넓은 청중에게, 특히 비 인간 및 비 동물 유기체에 가져오는 것입니다. 과거에 대한 대체 방법은 종종 인간이나 동물에 초점을 맞춘 명령줄 프로그램입니다. 사용자 친화성은 광택 응용 프로그램을 개발하기로 선택하고 응용 프로그램을 출시하기 위해 R 및 바이오 전도체를 사용하기로 선택하는 등 PAST 개발의 주요 목표였습니다. 사용자는 PAST를 사용하기 위해 프로그램을 컴파일하는 방법을 배울 필요가 없습니다.
대부분의 유형의 분석 소프트웨어와 마찬가지로 PAST의 결과는 입력 데이터만큼만 양호합니다. 입력 데이터에 오류가 있거나 잘못 포맷된 경우 PAST는 실행되지 않거나 정보 없는 결과를 생성하지 못합니다. GWAS 데이터, LD 데이터, 주석 및 경로 파일의 형식이 올바르게 지정되도록 하려면 PAST에서 올바른 출력을 받는 데 매우 중요합니다. 과거는 이중 동선 마커만 분석하고 각 입력 데이터 집합에 대해 하나의 특성만 실행할 수 있습니다. 또한, 불량 한 유전 또는 부정확한 phenotyping에 의해 생성 된 GWAS 데이터 도 명확하거나 반복 가능한 결과 생성 가능성이 없습니다. 과거는 GWAS 결과의 생물학적 해석에 도움이 될 수 있지만 환경 변화, 실험 적 오류 또는 인구 구조가 제대로 고려되지 않은 경우 혼란스러운 데이터 세트를 명확히 할 가능성은 낮습니다.
사용자는 Shiny 응용 프로그램에서 이러한 매개 변수를 R 콘솔의 PAST 함수에 전달하여 분석의 일부 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 PAST에서 보고한 결과를 변경할 수 있으며 사용자는 기본값에서 이를 수정할 때 주의해야 합니다. LD는 사용자에 의해 측정되기 때문에, 일반적으로 GWAS에서 도 사용 된 동일한 마커 데이터 세트를 사용하여, LD 측정은 인구에 특정. 모든 연구, 특히 옥수수 이외의 종에 대 한, (특히 자기 수 분, polyploid, 또는 높은 이종 종), 기본값의 변경 보증 될 수 있습니다.
저자는 공개 할 것이 없습니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 컴퓨터 | NA | NA | 8GB RAM이 있는 모든 컴퓨터에는 충분해야 합니다 |
| R Project | NA | R 4.0 이상을 설치해야 Bioconductor 3.11에서 설치할 수 있습니다. |
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청An erratum was issued for: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information. One of the affiliations was updated.
The second affiliation was updated from:
USDA-ARS Corn Host Plant Resistance Research Unit, Mississippi State University
to:
Corn Host Plant Resistance Research Unit, USDA-ARS