여기에 제출된 것은 낭포성 섬유증(CF) 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염 및 파지 치료 응용 프로그램에 대한 프로토콜이다.
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이 논문에서
요약
초록
항균 저항, 진단 불확실성및 항균 과처방의 주요 결과, 우리 사회와 건강 시스템에 큰 영향을 미치는 전 세계적으로 심각한 감염, 합병증 및 사망의 점점 인식되는 원인입니다. 특히, 면역 체계가 손상되거나 낭포성 섬유증(CF)과 같은 기존 및 만성 병리를 가진 환자는 다약물 내성 분리물의 출현 및 확산으로 감염을 제어하는 빈번한 항생제 치료를 받게 된다. 따라서 세균 감염에 대처하기 위한 대체 요법을 해결해야 할 긴급한 필요성이 있습니다. 박테리아의 자연적인 적인 박테리오파지의 사용은 가능한 해결책이 될 수 있습니다. 이 작품에 자세히 설명 된 프로토콜은 CF 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염에 대한 파지 치료의 적용을 설명합니다. Zebrafish 배아는 CF 배아에서 치사성, 세균성 부담 및 염증성 면역 반응을 감소시키기 때문에 파지 치료가 P. aeruginosa 감염에 효과적이라는 것을 증명하기 위해 P. aeruginosa에 감염되었습니다.
서론
파지 요법은 세균 감염과 싸우기 위해 박테리아의 자연적인 적의 사용으로 항생제에 대한 세균 저항이 널리 퍼지면서 새로운 관심을 얻고 있다1,,2. 동유럽에서 수십 년 동안 사용되는 이 치료법은 CF 를 사용한 환자에서 폐 감염을 경화시키는 항생제에 대한 보완적 치료법으로 간주될 수 있으며 현재 사용 중인 모든 항생제에 내성이 있는 박테리아에 감염된 환자에 대한 가능한 치료 대안으로 간주될 수 있다2,,3. 항생제 치료의 장점은 세균세포가 감염 부위에서 증식하는 반면 항생제는 대사되고4신체4,5에서제거된다는 것이다. 실제로, 다른 실험실에서 분리된 악성 파지의 칵테일의 투여는 곤충과 포유류6,67,7,8과다른 동물 모델의 슈도모나스 아루기노사 감염을 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 파지 요....
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프로토콜
AB 균주(유럽 제브라피시 자원 센터 EZRC)의 성인 제브라피쉬(Daniorerio)는국제(EU 지침 2010/63/EU) 및 국가 지침(2014년 3월4일, n.26)에 따라 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 따라 유지됩니다. 표준 조건은 28 ° C에서 빛 / 10 h 어두운 주기와 탱크 수온의 14 h와 물고기 시설에서 설정됩니다.
1. 솔루션 및 도구 준비
- 성장하는 제브라피시 배아를 위한 E3 배아 배지에 대한 50배 스톡 솔루션과 1배 작동 용액을 준비한다(표 1참조).
- 색소 침착 차단 용액을 만들고, 배아 색소 침착을 24 시간 후 수정 (24 hpf)에서 차단합니다 (표 1참조).
- 표 1에설명된 대로 25배 스톡 및 1배 작동 트리케인 마취용액을 준비한다.
참고: 재고 용액을 손상시킬 수 있는 용액의 반복된 동결 및 해동을 피하기 위해 25x 트리카인 2mL의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 -20°C에 보관하십시오. - 마이크로 웨이브 플라스크 또는 병에 증류 된 H2O의 100 mL에서 아가로즈 1 ....
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결과
여기에 제시된 결과 및 수치는이전에 설명된 바와 같이 cftr 모르폴리노스의 주입을 통해 생성된 CF 배아를 참조하고 5단계에서. CF 표현형을 검증하기 위해, 이전에 설명된바와 같이 심장, 간 및 췌장과 같은 내부 장기의 손상된 위치(도1)가고려되었다. 이전간행물(19)에보고된 바와 같이 WT 배아의 경우 유사한 결과를 얻었다.
PAO1에 감염된 CF 배아에서 파지 요법에 의해 세균부담이 감소하였다. 더욱이, 15개의 배아의 군을 균질화시킴으로써 8마피에서 세균부담을 평가하였다: PAO1 감염배아에 존재하는 박테리아(cfu/embryo)의 평균 수는 파지 투여 후 약 20%로 감소하여 파지 칵테일의 존재시보다 덜 심각한 감염을 확인하였다(도2)........
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토론
이 원고에서, 우리는 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa (PAO1) 감염을 능력을 발휘하는 프로토콜을 설명하고 그것을 해결하기 위하여 PAO1를 감염시킬 수 있는 이전에 확인된 파지의 칵테일으로 파지 치료를 적용하는 방법을 기술했습니다. 항생제 치료에 대 한 대안으로 박 테리 오 파 지의 사용은 지난 몇 년 이후 증가 관심의 되었습니다. 이것은 주로 공중 보건을 위한 심각한 문제점을 구성하는 다중 약 저항하는 (MDR) 세균성 감염의 확산 때문입니다. 물론, 이 작품의 범위는 인간이 아닌 동물 모델에 파지 요법을 적용하는 것으로 제한됩니다. 그러나, 우리는 CFtr 유전자를 표적으로 하는 모르폴리노의 주입을 가진 낭포성 섬유증 제브라피시 모형을 생성했습니다, 또한 P.aeruginosa 감염에 영향을 받기 쉬운 병리 유전학 모형에서 파지 치료의 효험을 보여주는.
전작과 마찬가지로 파지 요법을 쉽게 달성할 수 있었고, .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 이탈리아 낭포성 섬유증 재단 (FFC #22/2017)에 의해 지원되었다; 아소시아지오네 "글리 아미치 델라 리티" 카스키고와 FFC #23/2019; 피우 온루스 라 마노 테사 온루스에서 Un respiro).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| 염화칼슘 | 시그마 -알드리치 | 10043-52-4 | |
| CsCl | 시그마 - 알드리치 | 289329 | |
| 둘베코의 인산 완충 식염수 PBS | 시그마 - 알드리치 | D8537 | |
| 에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이 | 트 시그마 -알드리치 | 886-86-2 | 일반 이름 : 트리카인 |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| 저용융 아가로스 | 시그마-알드리치 | CAS 9012-36-6 | |
| 황산마그네슘 | 시그마-알드리치 | 7487-88-9 | |
| 메틸 블루 | 시그마 알드리치 | 28983-56-4 | |
| 미세 주사 바늘 | 하버드 장치 | ||
| N-Phenylthiourea > = 98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| 연구원이 설계한 | 고 모르폴리노 | 유전자 도구 | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| 페놀 레드 솔루션 | 시그마-알드리치 | CAS 143-74-B | |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| 염화나트륨 ACS 시약, ≥ 99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 실체현미경 | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 트립톤 | 옥소이 | 드 LP0042B | |
| 효모 추출물 | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word 정밀 기기 |
참고문헌
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A.
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재인쇄 및 허가
