이 논문은 우수한 자궁 경부 신경교에서 배아 쥐 동정 뉴런의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 또한 면역 세포화학 염색및 질량 분광 분석을 위한 신경 추출물을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 쥐 우수한 자궁 경부 신경리아 (SCG)에서 동정 뉴런은 축축성장, 축축인 인신 매매, 시냅토 발생, 수지상 성장, 수지상 가소성 및 공동 배양 시스템에서 신경 표적 상호 작용을 연구하기 위해 말초 뉴런을위한 시험관 내 모델 시스템으로 사용되어 왔다. 이 프로토콜은 E21 쥐 배아의 우수한 자궁 경부 중화로부터 뉴런의 격리 및 해리를 설명하고, 혈청이없는 배지에서 순수한 뉴런 배양의 준비 및 유지 보수에 따른다. 뉴런은 코팅되지 않은 플라스틱을 부착하지 않기 때문에 뉴런은 12mm 유리 커버립 또는 폴리 D-리신으로 코팅된 6웰 플레이트에서 배양됩니다. 항미항제(Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside)로 치료한 후, 이 프로토콜은 체외에서 한 달 이상 유지될 수 있는 5% 미만의 비신경 세포를 가진 건강한 뉴런 배양을 생성합니다. 배아 쥐 SCG 뉴런은 생체 내 5-8 원원염으로 다극성이지만; 혈청없는 조건하에서, 이 뉴런은 문화에 있는 단 하나 축록소를 확장하고 문화의 기간 동안 단극성 계속합니다. 그러나, 이들 뉴런은 지하 막 추출물, 뼈 형태유전학 단백질(BMP) 또는 10% 태아 종아리 혈청이 존재하여 수상월을 연장하도록 유도될 수 있다. 이러한 균질성 신경 배양은 면역 세포화학 염색 및 생화학 연구에 사용될 수 있습니다. 이 논문은 또한 이러한 뉴런에서 미세 투과 관련 단백질-2 (MAP-2)에 대한 면역 세포화학 염색및 질량 분석법을 위한 신경 추출물의 제조를 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.
서론
Sympathetic neurons derived from embryonic superior cervical ganglia (SCG) have been widely used as a primary neuronal culture system for studying many aspects of neuronal development including growth factor dependence, neuron-target interactions, neurotransmitter signaling, axonal growth, dendrite development and plasticity, synaptogenesis and signaling mechanisms underlying nerve-target/neuron-glia interactions1,2,3,4,5,6,7,<....
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프로토콜
동물과 관련된 연구에서 수행 된 모든 절차는 캘리포니아 세인트 메리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 세인트 메리 대학의 동물 관리 및 사용 지침은 국립 보건 원 (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf 및 https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)의 실험실 동물 복지 사무소에서 제공하는 지침에 따라 개발되었습니다.
1. 문화 매체 의 준비 (제어 매체라고도 함)
- DMEM에서 아래 나열된 순서대로 멸균 500mL 플라스크에 190mL, 20 mg/mL 지방산 프리 소 세럼 알부민(FAF-BSA)의 10mL, DMEM의 10mL, 200mM L-글루타민의 2.8mL, 인슐린 셀레늄-트랜스퍼린 혼합물 4mL, 125 μg/mL 신경 성장 인자(DMEM의 0.2% 불활성 단백질 안정제), 함F-12 중형 200mL.
- 파이펫에 단백질의 집착을 방지하기 위해 인슐린 셀레늄 -transferrin 및 NGF와 같은 단백질 함유 용액이 첨가되기 전에 FAF-BSA를 함유하는 배지....
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결과
배아 SCG 뉴런의 신경 배양을 고립시키고 유지
쥐 배아 SCG로부터 해리된 세포는 폴리-D-리신 코팅 플레이트 또는 커버슬립으로 도금되어 b-신경 성장 인자를 함유한 혈청 자유 배양 배지에서 유지하였다. 뉴런과 신경교 세포의 혼합물을 포함하는 해리된 세포는 도금 시 원형으로보입니다(도 1A). 도금 24시간 이내에 뉴런은 국외 세포가 평평해지고 위상 암흑이 나타나는 작은 축축 과정을확장합니다(그림 1B). 아라-C로 치료한 후, 교반세포의 99%가 제거되고 배양은 타원형 세포 체, 광범위한 축축산 및 훈장 없음을 가진 주로 뉴런 세포를 함유하고있다(도 1C).
배양 배아 쥐 우수한 자궁 경부 신경신경의 면역 세포화학 염색
이전 연구에 따르면 혈청이 .......
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토론
이 논문은 배아 쥐 새끼의 우수한 자궁 경부 신경교에서 동정 신경을 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델 시스템을 사용하는 장점은 성장 인자에 유사한 반응을 제공하는 뉴런의 균일한 집단을 얻을 수 있고, 이러한 뉴런에 대한 성장 인자 요구 사항이 잘 특징적이기 때문에, 혈청이 없는 조건 하에서 정의된 매체에서 이러한 뉴런을 성장시킬 수있다. 프로토콜은 E21 쥐 새끼로부터 SCG를 격리하는 과정을 설명하지만, 이 프로토콜은 E17에서 E21까지 의 랫 트 새끼에서 SCG의 해부및 배아 마우스 SCG10,,22,,23의해부에 사용될 수 있다. 이 해부 프로토콜은 또한 초기 단계에 사소한 수정과 산후 쥐에서 SCG를 격리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 수정에는 C-섹션에 대한 필요성 제거, 이산화탄소를 이용한 산.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 세인트 메리 의 캘리포니아 대학에서 교수 개발 기금 과 여름 연구 프로그램 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 또한 데이비스에 캘리포니아 대학의 파멜라 린 박사와 UC 버클리 질량 분광시설에서 안토니 이아바론 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 그녀의 도움에 대한 세인트 메리 의 캘리포니아 대학의 대학 커뮤니케이션 사무실에서 헤일리 넬슨에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| 중탄산암모늄 | 시그마-알드리치 | 9830 | |
| BMP-7 | R& D Systems | 354-BP | |
| 소 혈청 알루민 | 시그마-알드리치 | 5470 | |
| 세포 스크레이퍼 | 코닝 | CLS-3010 | |
| 콜라겐 분해 효소 | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar 또는 Nunc 평평한 바닥 세포 배양 플레이트 | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate 완충 식염수(칼슘 및 마그네슘 무함유) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| 증류수 | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| 디티오트레이톨 | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - 저포도당 + 글루타민, + 피루브산 나트륨 | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| 지방산 무함유 BSA | Calbiochem | 126609 | 저포도당 DMEM |
| 미세 집게 Dumont no.4 및 no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| 해부용 집게 및 가위 | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| 유리 덮개 - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (칼슘 및 마그네슘 free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| 인슐린-셀레늄-트랜스페린(100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 유리 커버슬립용 마운팅 미디어 | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti-MAP2 항체 (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| 신경 성장 인자 | Envigo Bioproducts (이전 Harlan Bioproducts) | BT5017 | 재고 125 μ DMEM |
| 파라포름알데히의 | 0.2 | (100X | |
| ) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마-알드리치 | P0899 | |
| 프리오넥스 | 밀리포어 | 529600 | 10% 용액, 100mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 고화질 질량 분석기 | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - 시퀀싱 등급 | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega 또는 NEB | V511A, P8101S | 100 μ g 또는 5 X 20 mg |
| Waters 총 회수 바이알 | Waters Corporation | 186000385c |
참고문헌
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Re....
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재인쇄 및 허가
