여기에서 방법은 유산균 세포 없는 상체 (LCFS)의 항암 효과를 이해하기 위하여 제시됩니다. 대장암 세포선은 3D 배양에서 LCFS로 치료할 때 세포 사망을 보여줍니다. 스퍼로이드를 생성하는 과정은 스캐폴드와 제시된 분석 방법에 따라 최적화될 수 있으며 관련 시그널링 경로를 평가하는 데 유용하다.
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방법 논문
대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 원고는 프로바이오틱스배양으로 간주되는 유산균 발효 세포 배양에서 수퍼나티를 사용하여 암세포의 다세포 유형의 3차원(3D) 스페로이드에서 암세포 사망을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 유산균 세포 없는 상퍼나탄(LCFS)을 테스트하기 위해 3D 배양을 사용하는 것은 특히 L. 발효가 장 내항암 효과를 생성할 수 있기 때문에 2D 단층에서 테스트하는 것보다 더 나은 옵션입니다. L. 발효 상체는 3D 배양 조건에서 여러 대장암(CRC) 세포에 대한 증식 효과를 보유한 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 암세포 사망을 유도하는 L. 발효의 주목할 만한 능력을 입증하는 배양 모델과 강하게 관련이 있었다. 안정스페로이드는 아래에 제시된 프로토콜을 사용하여 다양한 CRC(대장암세포)로부터 생성되었다. 3D 스페로이드를 생성하는 이 프로토콜은 시간 절약및 비용 효율적입니다. 이 시스템은 여러 유형의 CRC 스페로이드에서 LCFS의 항암 효과를 쉽게 조사하기 위해 개발되었습니다. 예상대로, 실험 중 LCFS로 치료된 CRC 스페로이드는 qRT-PCR, 서부 블로팅 및 FACS 분석에 의해 분석된 특정 세포사멸 분자 마커를 발현하였다. 따라서, 이 방법은 세포 생존가능성을 탐구하고 항암제의 효능을 평가하는 데 유용하다.
서론
프로바이오틱스는 면역 항상성을 개선하고 에너지 대사를 주최하는 장내 가장 유리한 미생물입니다1. 유산균과 비피도박테리움의 프로바이오틱스는장2,3에서발견되는 가장 진보된 프로바이오틱스입니다. 이전 조사는 유산 균이 여러 암에 억제 및 항증식 효과가 있음을 보여 주었다, 대장암을 포함4. 또한, 프로바이오틱스는 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염5,6을예방한다. 그러나, probiotics와 대부분의 연구 2 차원에서 수행 되었다 (2D) 단층 고체 표면에 성장.
인공 배양 시스템은 암세포에 자연적이지 않은 환경 적 특징이 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 3차원(3D) 배양 시스템이7,8을개발하였다. 3D내암세포는 세포 생존가능성, 증식, 형태학, 세포통신, 약물 민감도, 생체내 관련성
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프로토콜
1. 세균 세포 배양 및 유산 균 세포 없는 상체체의 준비 (LCFS)
참고: 단계 1.2 – 1.9 혐기성 챔버에서 실시됩니다.
- L-시스테인이 들어 있는 MRS 한천 접시와 국물을 준비하고 오토클레이브를 통해 살균합니다.
- H2 혐기성 챔버에서 MRS 한천 플레이트를 20 ppm 산소로 37°C로 유지한 사전 배양한다.
- 해동 유산균 세균육및 항마판을 세균배양으로 접종한다(도1A(i).
- 단일 세균 식민지가 얻을 때까지 37 °C 및 20 ppm 산소에서 H2 혐기성 챔버에서 2 - 3 일 동안 박테리아를 배양한다.
- 훈게이트 형 무성 배양 튜브를 세척하고 건조시십시오. 배양 튜브를 121°C에서 15분 동안 자동 클락.
- 그런 다음 37°C 및 20 ppm 산소에서 H2 혐기성 챔버에서 튜브를 배양하여 산소를 제거합니다.
- 튜브에 MRS 국물의 2 - 3 mL을 배치합니다. 부틸 고무 스토퍼로 튜브를 밀봉하고 캡을 나사.
- 루프가 있는....
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결과
우리는 다양한 대장암 세포주로부터 스페로이드를 얻는 프로토콜을 설명합니다. 메틸셀룰로오스를 보충하셔야 스페로이드를 생성해야 했습니다. 우리는 또한 LCFS 준비의 방법을 제시하고 프로바이오틱스와 대장암 사이의 상관 관계를 연구하는 모델을 제시한다. 스페로이드 형성 및 LCFS 준비 프로토콜은 도 1A,B에괄호로 도시된다. 도 2A에도시된 바와 같이, 메틸셀룰로오스 농도는 0.6%로 암세포를 소형 스페로이드로 변환합니다. 이 결과는 스페로이드가 우리의 메틸셀룰로오스 프로토콜을 사용하여 대장암의 여러 모형에서 생성될 수 있다는 것을 표시합니다. 다음으로, 스페로이드는 25% LCFS로 처리되었고 형태는 48시간 후에 가벼운 현미경을 사용하여 연구하였다. 그림 3A에도시된 바와 같이, LCFS로 처리된 그룹의 스페로이드는 중단된 표면을 나타낸다........
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토론
인접한 세포및 세포외 매트릭스(ECM)를 포함하는 조직 미세환경은 조직 생성에 근본적이며 세포 성장 및 조직개발(13)의제어에 결정적인 역할을 한다. 그러나, 2D 배양은 세포 상호 작용의 중단과 같은 몇몇 단점이 있습니다, 세포 형태에 있는 변경, 세포 외 환경 및 분열 의 접근14. 3D 세포 배양 시스템은 생체 내 효과를 더 잘 재현하기 위해 엄격하게 연구되었으며, 체외암 검사15,16을위한 보다 정밀한 시스템으로 입증되었다. 화학요법17에대한 개인화된 반응을 보다 정확하게 예측하기 위한 모델 시스템이 필요하다.
3D 비계는 조직 공학을 위해 개발되었습니다. 그것은 종양 세포의 사용 가능한 공간을 나타내는 ECM의 대리 손실로 작용한다. 또한,.......
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공개 사항
저자는 관련 재무 공시가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 한국과학기술연구원이 지원하는 '화학및 방사선측정기준 수립', 2020-GP2020-0003, '생체재료 및 의료융합측정기준 및 기술개발', '2020-GP2020-0004 프로그램 보조금'을 지원했다. 이 연구는 과학기술정보통신부(MSIT), 국립연구재단(NRF-2019M3A9F3065868), 보건복지부(MOHW), 한국보건산업진흥원(KHIDI, HI20C0558), 산업통상자원부(MOTIE), 산업통상자원부(MOTIE) 및 한국산업기술연구원(MOTIE)의 평가(MOTIE)20009350 지원했다. ORCID ID (유희민: 0000-0002-5951-2137; 강덕진: 0000-0002-5924-9674; 김세일: 0000-0003-3465-7118; 이주은: 0000-0002-2495-1439; 이진아: 0000-0002-3661-3701). 박창우에게 실험에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
10% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔, 15-well, 15 µ l | Biorad | 4561036 | 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp 광학 접착 필름 | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 커버 |
| 10x 전송 버퍼 | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 투명, 비멸균, 500 튜브/팩, 10 팩 / 케이스 | Corning | SCT-200-C | 500 튜브 / 팩, 10 팩 / 케이스 |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석 | Promega | G9681 | 100μ 96웰 플레이트의 l/분석 |
| 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 | 시그마-알드리치 | 11697498001 | 20 |
| 코닝 인산염 완충 식염수, 칼슘과 마그네슘이 없는 1X, PH 7.4 & 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF 전사 멤브레인 | 피셔 사이언티픽 | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m 롤; 기공 크기: 0.45um |
| Falcon 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 포함 Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, 인증, 미국 원산지 | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA 합성 키트, 25 x 20 µ l rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 &마이크로; L rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| 락토바실러스 퍼멘텀 | 유형 배양을 위한 한국 컬렉션 | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa· s, 20°C에서 물에 2%; C) | TCI | M0185 | 500g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트(바코드 포함), 0.1mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 플레이트 |
| Millex-GS 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 33mm, 에틸렌 옥사이드 멸균 | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA 용해 및 추출 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| 재료/장비/소프트웨어 이름 | Company | 카탈로그 번호 | Comments/Description |
| anti - p-Iκ B&알파; (나-9) | 산타 크루즈 | sc-8404 | 200 µ g/mL |
| 안티-BclxL (H-5) | 산타 크루즈 | sc-8392 | 200 &마이크로; g/mL |
| 안티-PARP 1 (C2-10) | 산타 크루즈 | sc-53643 | 50 &마이크로; l 복수 |
| 항 -> - actin (C4) | 산타 크루즈 | sc-47778 | 200 µ g/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | 샌디에이고, 캘리포니아, 미국 | |
| Synergy HTX 다중 모드 마이크로플레이트 리더 | BioT | S1LFA | |
| CO2 인큐베이터 | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| 원뿔형 튜브 15ml | SPL | 50015 | |
| 원뿔형 튜브 50ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar 초저 부착 다중 웰 플레이트 | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar 초저 부착 다중 웰 플레이트 | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50mL 시약 저장용기, 5/백, 멸균 | Costar | 4870 | |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL 자동 세포 계수기 | invitrogen | ||
| AMQAF1000 EnSpire 멀티모드 리더 | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus 멀티 채널 피펫, 8채널 | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo 소프트웨어 | TreeStar | 미국 오리건주 애쉬랜드 | |
| 안티 마우스 IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| 염소 안티 래빗 IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| 인큐베이션 쉐이커 | 랩 컴패니언 | SIF-6000R | |
| 멀티 게이지 Ver. 3.0, | 후지필름 | 일본 도쿄 | |
| 광학 밀도 (OD)LAMBDA UV/Vis 분광 광도계 | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| 위상차 현미경 | Olympus | 일본 도쿄 | |
| SPL 마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL 다중 채널 저장소, 12-Chs, PS, 멸균 | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 | Thermo Fisher Scientific | 미국 매사추세츠주 월섬 | |
| Vibra-Cell 초음파 액체 프로세서 | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500W 초음파 프로세서 |
| 비닐 혐기성 챔버 | COY LAB PRODUCTS |
참고문헌
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A.
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