CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
리신 아세틸 트랜스퍼라제 (KATs)는 크로마티닌 역학 및 유전자 발현을 조절하기 위해 히스톤 및 기타 단백질에 대한 리신 잔류물의 촉매 아세틸화. CBP/p300과 같은 KAT는 다양한 암의 종양 발생에 중요한 역할때문에 치료 대상으로 강도 높은 조사를 받고 있습니다. KATs의 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제(HAT) 기능을 대상으로 하는 새로운 소분자 억제제의 개발은 도전적이며 잠재적 억제제의 특이성과 효능을 검증할 수 있는 강력한 작용이 필요합니다.
이 문서에서는 새로운 HAT 억제제(HATi)에 대한 엄격한 체외 검증을 제공하는 세 가지 방법의 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법에는 시험관 HAT 분석, 크로마티닌 고과실화 억제(ChHAI) 분석, 크로마티닌 면역 침전-정량성 PCR(ChIP-qPCR)이 포함된다. HAT 분석에서 재조합 HAT는 시험관 반응에서 히스톤으로 배양되어 히스톤 꼬리에 특정 리신 잔류물을 아세틸화할 수 있습니다. 이러한 반응은 HATi에 의해 차단될 수 있으며, 현장별 히스톤 아세틸화의 상대적 수준은 면역블로팅을 통해 측정될 수 있다. HAT 분석에서 확인된 억제제는 세포 환경에서 확인되어야 합니다.
ChHAI 분석체는 히스톤 디스틸라제 억제제(HDACi)에 의해 유도된 히스톤의 견고한 hyperacetylation을 감쇠하는 새로운 HATi를 위해 면역 블로팅을 사용합니다. HDACi의 추가는 히스톤 아세틸화의 기저 수준이 면역 블로팅을 통해 검출하기 어려울 수 있기 때문에 도움이 됩니다.
HAT 및 ChHAI 아세서는 히스톤 아세틸화의 글로벌 변화를 측정하지만 특정 게놈 지역에서 아세틸화에 관한 정보를 제공하지는 않습니다. 따라서 ChIP-qPCR은 유전자 조절 원소에서 히스톤 아세틸화 수준에 대한 HATi의 효과를 조사하는 데 사용됩니다. 이는 그의 톤-DNA 복합체의 선택적 면역 침전및 qPCR을 통해 정제된 DNA의 분석을 통해 달성된다. 이 세 가지 에세이는 함께 새로운 HATi의 특이성, 효능 및 작용 메커니즘에 대한 신중한 검증을 가능하게 합니다.
서론
리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 히스톤과 비히스톤 단백질11,2,,3,,4모두에서 리신 잔류물의 아세틸화를 촉매한다. 최근 연구에 따르면 KAT와 그들의 아세틸트랜스퍼라아제 기능은 고형 종양성장을촉진할 수 있음을4,5,,6,,7,,8,,9. 예를 들어, CREB 결합 단백질(CBP)/p300은 암2,,3에서수많은 신호 경로를 조절하는 두 개의 파라로고우스 KAT이다. CBP/p300은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 기능을 잘 특성화하고 히스톤 3 리신 27아세틸레이션(H3K27ac)
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 체외 HAT 분석
- 버퍼 준비
참고: 버퍼 레시피의 표 1을 참조하십시오.- 5배 분석 버퍼와 6배 의 도데킬 설페이트 나트륨(SDS)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. 알리쿼트 SDS 에서 1 mL 알리쿼트.
- 10x SDS 젤 러닝 버퍼와 10배 TBST를 준비하고 실온에서 보관하십시오.
- 1x 이송 버퍼를 준비하고 4°C에 보관하십시오.
주의: 이 프로토콜에 사용되는 모든 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트를 확인합니다. SDS, DTT 및 브로모페놀 블루는 독성이 있으며 피부 나 눈에 섭취, 흡입 또는 노출되어서는 안됩니다. 적절한 취급 절차를 위해 안전 데이터 시트를 참조하십시오. 위험한 화학 물질을 취급하기 위해 화학 연기 후드를 사용하십시오.
- HAT 반응
참고: 아나카르산은 알려진 p300 억제제3이며 HAT 분석이 새로운 p300 억제제를 식별하는 방법을 보여주는 예로 사용됩니다. 단계 1.2.1의 회로도에 대한 보충 프로토콜 (회로도 1)을참조하십시오.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 분석은 히스톤 기판을 향해 p300 HAT 활성을 억제하는 화합물을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 도 1A는 HAT 분석에 대한 실험 적인 회로도를 제공합니다. 알려진 HATi3,38인아나카르산은 12.5-100 μM의 농도 범위에서 이 분석에서 활용되었다.3 100 μM에서 아나카르산 다운조절은 히스톤 3, 리신 9, 18에서 p300의 촉매처리된 히스톤 아세틸화를 대조하는 DMSO처리(도 1B,레인 5 대 레인 1)이다. 낮은 약물 투여량이 p300 HAT 활성을 크게 억제하지 못할 수 있기 때문에 농도 범위가 이 분석에서 활용되었다(도1B,차선 2-4 대 레인 1). 레인 6에서는, 아니 아세틸-CoA는 반응에 첨가되.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 유전자전사를조절하기 위한 히스톤 꼬리 및 전사 인자에 대한 여러 리신 잔류물을 아세틸레이트2,3. 지난 2년간의 연구에 따르면 CBP/p300, PCAF 및 GCN5와 같은 KAT는 종양 발생 성 전사 인자와 상호 작용하고 여러 고형 종양 유형4,,5,9,9,15,,16,,17,,18에서종양 성장을 촉진하는 데 도움을 주는 것으로 나타났습니다. 종양 성장을 촉진하는 그들의 새로운.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이나 공개가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 제임스와 에스더 킹 생물 의학 연구 프로그램 (6JK03 및 20K07)과 Bankhead-Coley 암 연구 프로그램 (4BF02 및 6BC03), 플로리다 보건부, 플로리다 유방암 재단 및 UF 건강 암 센터의 보조금에 의해 지원되었습니다. 또한, 우리는 출판 과정에서 그들의 지원에 대한 박사 Zachary Osking과 안드레아 린 박사에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5ml 튜브 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 모든 방법용 |
| 10cm 접시 | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | MCF-7 세포의 세포 배양용 |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | 모든 방법용 |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | 모든 방법용 |
| 10X 글리신 완충액 | 방법 3. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 10X 실행 버퍼 | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 10X TBST | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 12 웰 플레이트 | Corning | 3513 | 방법 2 |
| 15cm 접시 | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | 방법 3 |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | 방법 2 및 3 |
| 1X TBST 5 % 우유 및 0.02 % 아지드 | 나트륨 방법 1 및 2. 두 번 이상 사용될 1차 항체를 희석하는 데 사용할 수 있습니다. 1차 항체 희석액을 단기간 보관할 수 있습니다. 2차 항체 희석톤에는 사용하지 마십시오. 주의: 아지드화나트륨은 독성이 있습니다. | ||
| 5% 우유 | . PVDF 멤브레인을 차단하고 항체 딜션에 사용됩니다. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 200 ul 팁 | Corning | 4844 | 모든 방법용 |
| 2-메르캅토에탄올 | SDS 샘플 완충액 준비용 | Sigma-Aldrich | M3148 |
| 4-20% 폴리아크릴아미드 겔 | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | 방법 1 및 2용 |
| 5X 분석 버퍼 | 1. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 5X 수동 용해 버퍼 | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 6X 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) | 방법 1 및 2. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 분석기 방법 2 및 3에 사용됩니다. DMSO에 디졸브됩니다. |
| 아세틸-CBP(K1535)/p300(K1499) 항체 | 세포 신호 기술 | 4771 | 방법 1 |
| 에 사용하기 위한 | 아세틸-CoA | 시그마-알드리치 | A2056 |
| 아세틸-히스톤 H3(Lys 27) 항체(H3K27ac) | 세포 신호 기술 | CST 8173 | 면역블롯 및 ChIP용 H3K27ac용 안토이바디 |
| 아세틸-히스톤 H3(Lys18) 항체(H3K18ac) | 세포 신호 기술 | CST 9675 | 면역 블롯 용 H3K18ac 용 안토 이바디 및 ChIP |
| 알파 튜불린 항체 | Millipore Sigma | T5168 | 방법 2. 희석 1:20,000 |
| 아나카르딕산 | 케이맨 화학 | 13144 | 방법 1 |
| 안티 마우스 IgG HRP 연결 2차 항체 | 세포 신호 전달 기술 | 7076 | 방법 1 및 2의 경우. 희석 1:10,000 |
| 항토끼 IgG 2차 항체 | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | 방법 1 및 2용. 1:10,000 - 1:20,000 |
| 자동 방사선 촬영 필름 | MIDSCI | BX810 | 방법 1 및 2 |
| 벨리 댄서 회전 플랫폼 | Stovall Life Science Incorporated | 사용할 수 없음 | 방법 1 및 2용 |
| 소 송아지 혈청(BCS) | HyClone | SH30072.03 | 세포 배양 배지 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| SDS 샘플 완충액 준비용 | 브로모페놀 블루 | 시그마-알드리치 | B0126 |
| CDTA | 스펙트럼 화학 물질 | 125572-95-4 | 완충액 준비 |
| 용 셀 스크레이퍼 | Millipore Sigma | CLS3010 | 방법 3용 |
| ChIP 희석 완충액 | 방법 3. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| ChIP 용리 버퍼 | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| MCF-7 세포 | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 코바리스 130 &마이크로; l microTUBE | S220과 함께 사용하기위한 | Covaris | |
| 520045 초음파 처리 튜브 Covaris S220 집속 초음파 발생기 | Covaris | S220 | DNA 초음파 발생기 방법 3에 사용하기 위해 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | 약물 희석 및 차량 제어 처리를 위해 |
| 43815 | Sigma-Aldrich | 완충 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 세포 배양 매체 |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| 예 이송 탱크 및 이송 장치 | Bio-rad | 1704070 | 방법 1 및 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G 염색질 면역침전 키트 | Millipore Sigma | 17-10086 | 방법 3 |
| FK228 ( Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | 방법 2에 사용하기위한 HDAC 억제제 |
| 포름 알데히드 용액 | Sigma-Aldrich | F8775 | 세포 고정 |
| 글리세롤 | Fisher Scientific | BP229-1 | 완충 제 |
| 글리신 | Sigma-Aldrich | G7126 | 완충 제 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | 완충제 제제 |
| 염 세척 완충액 | 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | 완충액 제제 |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | Method 1 및 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 완충제 준비 |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | 완충액 준비용 |
| LiCl 세척 완충액 | 방법 3용. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 저염 세척 버퍼 | 방법 3. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 자기 분리기 | Promega | Z5341 | 방법 3에 사용 |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | 494437 | 완충액 준비에 사용 |
| 미니 겔 탱크 | Invitrogen | A25977 | 방법 1 및 2 |
| MS-275 (Entinostat) | 케이맨 화학 | 209783-80-2 | 방법 2에 사용 HDAC 억제제. DMSO에 디졸브됩니다. |
| 완충액 준비를 위한 | NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 |
| 방법 1 및 2에서 완충액 준비를 위한 | NaOH Fisher Scientific | S318-100 | |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | 방법 3에 사용하기 위한 토끼 항체 제어 |
| 핵 팽창 완충액 | . 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| PCR 클린업 키트 | Qiagen | 28104 | 방법 3에 사용 |
| 페니실린/스트렙토마이신 100X | Corning | 30-002-CI | 세포 배양 매체 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Corning | 21-040-CV | 방법 2 및 3 |
| 파이프 | Sigma-Aldrich | 80635 | 완충 제제 |
| 분유 | 네슬레 카네이션 | 방법 1 및 2 | |
| 웨스턴 블롯 전달을 위한 Power Pac 200 | 방법 1 및 2를 위한 | Bio-rad | |
| SDS 젤을 실행하는 | 방법 1 및 2 | ||
| 경우 Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | 방법 1 및 2 |
| 경우 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | 방법 3 |
| 단백질 A, 마젠틱 비드에 사용 | New England BioLabs | S1425S | Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | Method 3 |
| PTC-100 프로그래밍 가능한 열 컨트롤러 | MJ Research | PTC-100 | 1 |
| PVDF 전사 멤브레인 | Millipore Sigma | IEVH00005 | 방법 1 및 2 재 |
| 조합 H3.1 | New England BioLabs | M2503S | 방법 1에 사용 |
| 조합 p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | 방법 1에 사용 |
| SAHA(Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | 방법 2에 사용하기 위한 HDAC 억제제 |
| SDS 용해 버퍼 | 방법 3의 경우. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | 방법 1 및 2. 주의: 아지드화나트륨은 독성이 있습니다. 적절한 취급은 SDS를 참조하십시오. |
| 완충액 준비용 | 중탄산 | Fisher Scientific | S233-500 |
| 듐 데옥시콜레이트 | 시그마-알드리치 | D6750 | 완충 |
| 듐 도데실 설페이트(SDS) | SDS 샘플 완충액 준비용 | 시그마-알드리치 | 71725 |
| 표준 히트블록 | VWR Scientific 제품 | MPN: 949030 | 방법 1 및 2 |
| 테이블 탑 원심분리기 | Eppendorf | 5417R | 모든 방법용 |
| TE 버퍼 | 방법 3용. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 전송 버퍼 | 방법 1 및 2에 대한 값입니다. 레시피는 표 1을 참조하십시오. | ||
| 트리코스타틴 A | 케이맨 화학, | 58880-19-6 | 방법 2에 사용하기 위한 HDAC 억제제 |
| 완충액 준비를 위한 | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 준비를 위한 |
| Tween 20 | 1 및 2의 완충액 준비를 위한 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
| X선 필름 프로세서 | 코니카 미놀타 메디컬 & 그래픽, Inc. | SRX-101A | 방법 1 및 2용 |
참고문헌
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveal....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
