방법 논문

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

DOI:

10.3791/61292

⸱

2020년 4월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.

초록

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Microvesicles 및 엑소좀은 세포 외 환경에 풀어 놓이고 바디를 통해 순환하는 작은 membranous 소포입니다. DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질과 같은 다양한 부모 세포 유래 생체 분자를 함유하고 있기 때문에, 그들의 농축 및 격리는 임상 응용을 위한 잠재적인 바이오마커로서 그들의 착취를 위한 중요한 단계입니다. 그러나, 종래의 절연 방법(예를 들어, 초원심분리)은 마이크로베실 및 엑소좀에 상당한 손실과 손상을 일으킨다. 또한 이러한 방법은 시약의 초원심 분리, 적재 및 낭비의 여러 반복 단계가 필요합니다. 이 문서에서는 간단한 방식으로 미세 채소와 외종의 효과적인 농축 및 절연을 위해 설계된 종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)를 제조하는 상세한 방법을 설명합니다. 수렴 시료 영역이 있는 아코디언형 다층으로 구성된 엑소-PAD의 독특한 디자인은 이온 농도 편광 기술과 통합되어 특정 층에서 마이크로베실과 외종의 5배 농축을 가능하게 한다. 또한, 농축된 마이크로베실과 엑소솜은 엑소-PAD를 펼치기만 하면 격리된다.

서론

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마이크로베식과 엑소좀은 각각 0.2-1 μm 및 30-200 nm를 측정하는 작은 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 몇몇 다른 세포,모형1,,2,3,,4,5에의해 세포 외 환경으로 분비됩니다., 그들은 DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질의 하위 집합의 형태로 부모 세포 정보를 포함하고, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수 및 타액6,,7,,8,,9와같은 다양한 체액을 통해 신체 전체를 순환한다. 따라서, 생물학적 유체로부터 미생물과 외종의 효율적인 분리를 위한 기술은 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 질병의 진단, 예후 및 실시간 모니터링 분야에서 광범위한 기회를 제공할 수 있다.

그러나, 초원심분리에 기초한 마이크로베실 및 엑소좀에 대한 종래의 절연 방법은 매우 시간이 많이 소요되고 시료의 상당한 손실 및 오염을 야기한다. 이는 여러 번거로운 파이펫팅 및 적재 단계와 반복된 초원심,분리5,6,,10,11,,12를포함하는 다양한 시약의 폐기를 수반하기 때문이다., 더욱이, 초원심심분리(~100,000 x g)에의해 유도되는 높은 전단 응력은 미생물과 외종의 물리적 용해를 유발하여 회복율(5-23%)6,,13,,14를산출할 수 있다. 따라서, 마이크로베식및 엑소좀을 위한 매우 효율적이고 눈에 거슬리지 않는 격리 기술은 손상과 손실을 줄이기 위해 개발되어야 하므로 더 높은 회수율을 달성해야 합니다.

종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)는 마이크로베실과 엑소좀6의간단하고 온화하며 매우 효율적인 격리를 위해 개발되었습니다. 엑소-PAD의 디자인은 지름이 점차 감소하는 일련 적으로 연결된 샘플 영역이 있는 다중 접힌 종이입니다. 이온 농도 편광(ICP) 기술은 전농축이 전하된 생체분자를 전하하는 나노 전기키네틱 현상이며, 이 독특한 설계와 통합되었다. Exo-PAD를 사용하면 특정 층에서 마이크로베식과 엑소좀이 5배 농축되고 장치를 전개하기만 하면 격리가 발생했습니다. 이 문서에서는 엑소-PAD를 자세히 설명하며, 전체 장치 제조 및 작동에서 사용 분석에 이르기까지 방법을 설명하고 대표적인 결과를 보여주는 6을설명한다.

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프로토콜

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1. 장치 제작

  1. 프린터 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 종이에 인쇄할영역을 정의합니다.
    참고: 원형 샘플 영역의 직경이 5mm에서 2mm(그림1A)로점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 설계되어 있습니다.
  2. 상업용 왁스 프린터(재료 표)를 이용하여 셀룰로오스용지(재료표)의양면에 지정된 부위에 소수성 왁스를인쇄한다(도1B).
  3. 왁스 인쇄 용지를 실험실 오븐에 넣고 80s를 120°C로 놓습니다.
    참고: 이 단계를 통해 왁스는 인쇄된 왁스의 열 리플로우를 달성하여 용지 내부에 도달할 수 있습니다. 이 인큐베이션 프로토콜을 사용하면 패턴의 해상도가 ~2mm입니다. 따라서 2mm 미만의 패턴을 인쇄하지 않도록주의하십시오.
  4. 왁스 프린트 용지를 커터로 잘라 개별장치(그림 1C)를만듭니다.
  5. 5 μL 및 퍼마 선택적 멤브레인의 2 μL을 떨어 뜨립니다 (예 : Nafion; 재료 의 표) 각각(도 1D)을왼쪽 과 오른쪽 레이어의 샘플 영역에.
  6. 파마선택적 멤브레인용을 증발시키기 위해 70°C에서 70°C의 파마선택적 멤브레인으로 코팅된 층을 30분 동안 배치한다.
  7. 버퍼 용액을 향하는 코팅된 층의 가장 바깥쪽 표면을 압력에 민감한 테이프로 밀봉하여 작은 구멍을 남깁니다.
  8. 인쇄된 개별 장치(예: 엑소-PAD)를 흰색 선을 따라 앞뒤로 접습니다.
    참고: 장치를 접음으로써 모든 샘플 영역이 수렴됩니다(그림1E). 이 수렴 설계는 전압이 ICP에 적용될 때 전기장 라인에 초점을 맞추고 미세 베실과 외종의 집중적 사전 농도를 달성합니다.

2. 이온 농도 편광에 의한 미생물과 외종의 농축 및 공간 초점

  1. 마이크로베식 및 외성 시료의 15 μL(~3 x 1011 μl/mL 0.1x 인산완충식염식염수면 [PBS]0.05% Tween 20)을 파이프팅하여 수렴 시료 부위에 적재하고 몇 초 정도 기다린 후 모든 시료영역(그림 1F)의완전한 습윤을 보장한다.
  2. 엑소-패드의 양쪽 끝에 아크릴 챔버 2개를 놓고 작은 바인더 클립으로 엑소-PAD를 단단히 고정하여전개(그림 1G)를방지합니다.
  3. 챔버를 0.1x PBS 110 μL로 채우고 2개의 Ag/AgCl 전극(도1H)을삽입합니다.
  4. 전류 전압 소스 측정 시스템(재료 표)을 사용하여 20분 동안 전극에 30V를적용합니다.
    참고: 적용된 전압은 ICP 현상을 생성하고 따라서 엑소-PAD의 8및 9층에 마이크로베실과 엑소좀을 미리 농축합니다.

3. 농축 된 미생물과 외종의 격리

  1. 접힌 엑소-PAD를 아크릴 챔버로부터 분리하고 장치를 전개하여 농축된 미생물과 엑소좀을 다른 층으로부터분리한다(도 1I).
  2. 마이크로베실과 엑소좀이 농축되는 층 8과 9층의 샘플 영역을 다운스트림분석(그림 1J)에펀치한다.

4. 전자 현미경 분석 스캐닝

  1. 농축 된 미생물과 엑소좀은 0.1 M 나트륨 코코디레이트 버퍼에서 2.5 % 글루타랄데히드에 1 시간 동안 1 % 오스뮴 테트옥사이드를 1 시간 동안 0.1 M 나트륨 코코디레이트에 담그어 농축 된 미생물과 외성부위를 수정합니다.
    주의: 오스뮴 테트옥사이드는 매우 유독하고 유해한 화학 물질입니다. 오스뮴 테트옥사이드는 플라스틱에 침투할 수 있기 때문에 유리에 보관해야 합니다. 오스뮴 테트산화물의 모든 처리는 이중 니트릴 장갑화학 연기 후드에서 수행해야합니다.
  2. 200 증거 에탄올의 상승 등급으로 고정 된 미생물과 외종 (즉, 50%, 70 %, 90 %, 및 100 %)을 탈수하십시오. 각각 30분 동안.
  3. 30분 동안 건조기에 hexamethyldisilazane에 침지하여 화학적으로 샘플을 건조시.
    주의: Hexamethyldisilazane은 인화성 및 수분 에 민감한 화학 물질입니다. 발화원에서 멀리 떨어진 건조하고 통풍이 잘 되는 지역에 보관해야 합니다.
  4. 완전히 말린 미생물과 외종에 금/팔라듐(~20nm)을 스퍼터링을 통해 코팅하고 스캔 전자 현미경(SEM) 이미지를 캡처합니다.

5. 나노 입자 추적 분석

  1. 장치 작동 20분 후 생검 펀치를 사용하여 6층, 8, 10층의 샘플 영역을 펀치한다.
  2. 버퍼 솔루션(0.01% Tween 20)에 각 펀치아웃 영역을 담급니다.
  3. 6,000rpm에서 10분 동안 원심분리기와 30s의 원심분리기를 통해 농축된 미생물과 외식을 재보일시 중단시합니다.
  4. 용액에서 펀치 아웃 영역을 제거하고 나노 입자 추적 분석 (NTA) 기기(재료의 표)에의해 마이크로베시날과 엑소좀의 농도를 측정합니다.

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결과

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농축 된 미생물 및 엑소좀의 최대 회수 율을 달성하기 위해 작동 시간을 최적화해야합니다. 시간이 부족하여 농축을 감소시키는 마이크로베식과 엑소좀의 충분한 이동을 허용하지 않는 반면, 과도한 시간은 공간 초점을 악화시키고 따라서 미세 채소와 외식을 분산시합니다. 따라서 시간 최적화 단계를 통해, 마이크로베식및 엑소좀의 최대 전농도 계수와 마이크로베실과 엑소좀이 가장 농축되는 최종 위치를 확인할 수 있다. 미생물과 외종의 최종 위치를 찾기 위해, 형광으로 표지된 미생물및 엑소좀의 시간 경과 이동은현미경(도 2A)으로관찰되었고 모든 샘플 영역에서형광 강도는 ImageJ 소프트웨어(그림2B)를사용하여 정량화하였다. 농축 공정(도2A,0분) 전에, 마이크로베실과 엑소좀은 종이 매트릭스의 약간의 여과 작용(도2B,0분)으로 인해...

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토론

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엑소-PAD는 마이크로베실과 외종의 농축 및 절연을 위해 성공적으로 사용되었지만, 여러 가지 중요한 점은 신중하게 고려해야 합니다: 1) 장치 제조 중 오븐 잠복기 시간과 온도, 2) 처리 시간, 3) 다양한 층 수와 샘플 영역 직경을 가진 전압의 적용, 그리고 4) 임상 샘플에 대한 적용가능성.

프로토콜에 주어진 인큐베이션 시간과 온도는 신뢰할 수 있는 장치를 조작하는 데 최적화된 조건이다. 더 긴 잠복 시간 또는 더 높은 온도는 인쇄 된 왁스의 과도한 리플로우로 인해 수렴 설계의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 이를 통해 집중된 전기장 라인의 형성을 방지하고 전기키네틱 농축 공정 중 의 이주 저항을 증가시킵니다.

처리 시간은 또한 최대의 농축 및 격리를 고려해야 하는 요소입니다. 마이크로베식및 엑소솜 이동을 허용하는 충분한 시간이 없기 때문에 <20 분의 처리 시간이 더 적은 사전 농도를 초래합니다. 한편, >20분의 처리 시간은...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 한국 국립연구재단인 그랜트 NRF-2018R1D1A09090840444가 지원했다. 이준은 2019년 광운대학교 연구보조금의 지원을 받았다. 김효린 은 한국과학기술원(KIAT)이 운영하는 산업통상자원부(MOTIE)의 '산업전문가를 위한 역량개발 프로그램'의 지원을 받았다. P0002397, 웨어러블 스마트 기기의 산업 융합을 위한 HRD 프로그램).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ag/AgCl 전극A-M 시스템, Inc.531500
소 혈청(BSA)의 0.15인치 직경 알부민, Alexa Fluor 594 접합체Thermo Fisher ScientificA13101BSA와 Alexa Fluor 594(Ex/Em: 590/617 nm)
탄산염-중탄산염 완충액Sigma-AldrichC3041-50CAP탄산염 완충액
CorelDraw 소프트웨어(Coral Co., Canada)Corel Corporation프린터 소프트웨어 지역
ColorQube 8870Xerox Corporation왁스 프린터
크로마토 그래피 종이 1 학년Whatman3001-861셀룰로오스 종이, 크기 : 20 * 20 cm
형광 표지 엑소좀 표준HansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100FITC로 표시된 엑소좀(Ex/Em: 490/520nm)
Keithley 2410 전류/전압 소스 미터Keithley Instruments, Inc.현재– 전압 소스 측정 시스템
Nafion perfluorinated resin solutionSigma-Aldrich31175-20-9Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34%
water NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle tracking analysis (NTA) machine
phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
왁스 인쇄를 정의하기 위한

참고문헌

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  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

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