제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.
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방법 논문
마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Microvesicles 및 엑소좀은 세포 외 환경에 풀어 놓이고 바디를 통해 순환하는 작은 membranous 소포입니다. DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질과 같은 다양한 부모 세포 유래 생체 분자를 함유하고 있기 때문에, 그들의 농축 및 격리는 임상 응용을 위한 잠재적인 바이오마커로서 그들의 착취를 위한 중요한 단계입니다. 그러나, 종래의 절연 방법(예를 들어, 초원심분리)은 마이크로베실 및 엑소좀에 상당한 손실과 손상을 일으킨다. 또한 이러한 방법은 시약의 초원심 분리, 적재 및 낭비의 여러 반복 단계가 필요합니다. 이 문서에서는 간단한 방식으로 미세 채소와 외종의 효과적인 농축 및 절연을 위해 설계된 종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)를 제조하는 상세한 방법을 설명합니다. 수렴 시료 영역이 있는 아코디언형 다층으로 구성된 엑소-PAD의 독특한 디자인은 이온 농도 편광 기술과 통합되어 특정 층에서 마이크로베실과 외종의 5배 농축을 가능하게 한다. 또한, 농축된 마이크로베실과 엑소솜은 엑소-PAD를 펼치기만 하면 격리된다.
서론
마이크로베식과 엑소좀은 각각 0.2-1 μm 및 30-200 nm를 측정하는 작은 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 몇몇 다른 세포,모형1,,2,3,,4,5에의해 세포 외 환경으로 분비됩니다., 그들은 DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질의 하위 집합의 형태로 부모 세포 정보를 포함하고, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수 및 타액6,,7,,8,,9와같은 다양한 체액을 통해 신체 전체를 순환한다. 따라서, 생물학적 유체로부터 미생물과 외종의 효율적인 분리를 위한 기술은 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 질병의 진단, 예후 및 실시간 모니터링 분야에서 광범위한 기회를 제공할 수 있다.
그러나, 초원심분리에 기초한 마이크....
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프로토콜
1. 장치 제작
- 프린터 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 종이에 인쇄할영역을 정의합니다.
참고: 원형 샘플 영역의 직경이 5mm에서 2mm(그림1A)로점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 설계되어 있습니다. - 상업용 왁스 프린터(재료 표)를 이용하여 셀룰로오스용지(재료표)의양면에 지정된 부위에 소수성 왁스를인쇄한다(도1B).
- 왁스 인쇄 용지를 실험실 오븐에 넣고 80s를 120°C로 놓습니다.
참고: 이 단계를 통해 왁스는 인쇄된 왁스의 열 리플로우를 달성하여 용지 내부에 도달할 수 있습니다. 이 인큐베이션 프로토콜을 사용하면 패턴의 해상도가 ~2mm입니다. 따라서 2mm 미만의 패턴을 인쇄하지 않도록주의하십시오. - 왁스 프린트 용지를 커터로 잘라 개별장치(그림 1C)를만듭니다.
- 5 μL 및 퍼마 선택적 멤브레인의 2 μL을 떨어 뜨립니다 (예 : Nafion; 재료 의 표) 각각....
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결과
농축 된 미생물 및 엑소좀의 최대 회수 율을 달성하기 위해 작동 시간을 최적화해야합니다. 시간이 부족하여 농축을 감소시키는 마이크로베식과 엑소좀의 충분한 이동을 허용하지 않는 반면, 과도한 시간은 공간 초점을 악화시키고 따라서 미세 채소와 외식을 분산시합니다. 따라서 시간 최적화 단계를 통해, 마이크로베식및 엑소좀의 최대 전농도 계수와 마이크로베실과 엑소좀이 가장 농축되는 최종 위치를 확인할 수 있다. 미생물과 외종의 최종 위치를 찾기 위해, 형광으로 표지된 미생물및 엑소좀의 시간 경과 이동은현미경(도 2A)으로관찰되었고 모든 샘플 영역에서형광 강도는 ImageJ 소프트웨어(그림2B)를사용하여 정량화하였다. 농축 공정(도2A,0분) 전에, 마이크로베실과 엑소좀은 종이 매트릭스의 약간의 여과 작용(도2B,0분)으로 인해.......
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토론
엑소-PAD는 마이크로베실과 외종의 농축 및 절연을 위해 성공적으로 사용되었지만, 여러 가지 중요한 점은 신중하게 고려해야 합니다: 1) 장치 제조 중 오븐 잠복기 시간과 온도, 2) 처리 시간, 3) 다양한 층 수와 샘플 영역 직경을 가진 전압의 적용, 그리고 4) 임상 샘플에 대한 적용가능성.
프로토콜에 주어진 인큐베이션 시간과 온도는 신뢰할 수 있는 장치를 조작하는 데 최적화된 조건이다. 더 긴 잠복 시간 또는 더 높은 온도는 인쇄 된 왁스의 과도한 리플로우로 인해 수렴 설계의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 이를 통해 집중된 전기장 라인의 형성을 방지하고 전기키네틱 농축 공정 중 의 이주 저항을 증가시킵니다.
처리 시간은 또한 최대의 농축 및 격리를 고려해야 하는 요소입니다. 마이크로베식및 엑소솜 이동을 허용하는 충분한 시간이 없기 때문에 <20 분의 처리 시간이 더 적은 사전 농도를 초래합니다. 한편, >20분의 처리 시간은.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 한국 국립연구재단인 그랜트 NRF-2018R1D1A09090840444가 지원했다. 이준은 2019년 광운대학교 연구보조금의 지원을 받았다. 김효린 은 한국과학기술원(KIAT)이 운영하는 산업통상자원부(MOTIE)의 '산업전문가를 위한 역량개발 프로그램'의 지원을 받았다. P0002397, 웨어러블 스마트 기기의 산업 융합을 위한 HRD 프로그램).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ag/AgCl 전극 | A-M 시스템, Inc. | 531500 | |
| 소 혈청(BSA)의 0.15인치 직경 알부민, Alexa Fluor 594 접합체 | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA와 Alexa Fluor 594(Ex/Em: 590/617 nm) |
| 탄산염-중탄산염 완충액 | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | 탄산염 완충액 |
| CorelDraw 소프트웨어(Coral Co., Canada) | Corel Corporation | 프린터 소프트웨어 지역 | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | 왁스 프린터 | |
| 크로마토 그래피 종이 1 학년 | Whatman | 3001-861 | 셀룰로오스 종이, 크기 : 20 * 20 cm |
| 형광 표지 엑소좀 표준 | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | FITC로 표시된 엑소좀(Ex/Em: 490/520nm) |
| Keithley 2410 전류/전압 소스 미터 | Keithley Instruments, Inc. | 현재– 전압 소스 측정 시스템 | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% |
| water NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
참고문헌
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....
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재인쇄 및 허가
