미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

요약

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

초록

미토콘드리아가 온코겐성 변화에 기여하는 것은 광범위한 관심과 적극적인 연구의 대상입니다. 암 대사 분야가 더욱 복잡해짐에 따라 미토콘드리아 손상(소위 미토칸)을 가하는 다양한 화합물을 이용한 미토콘드리아를 표적으로 하는 것이 매우 인기를 끌고 있습니다. 불행히도, 테트라졸륨 염이나 레사쥐린을 기반으로 하는 것과 같은 많은 기존 세포 독성 작용제는 그들의 성능을 위해 기능적인 미토콘드리아 효소가 필요합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 화합물에 의해 가해진 손상은 수시로 이 심세의 정확도를 손상합니다. 여기서는 두 개의 형광 염료를 가진 차동 염색에 기초하여 변형된 프로토콜을 설명하고, 그 중 하나는 세포 분산(Hoechst 33342)이고 다른 하나는 그렇지 않다(예의 요오드). 염색의 차이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 차별할 수 있게 합니다. 분석법은 처리량을 증가시키고 편견을 감소시키는 자동화된 현미경 검사법과 이미지 분석에 사용가능합니다. 이것은 또한 96 웰 플레이트를 사용하여 고처리량 방식으로 분석방법을 사용할 수 있게 해주며, 특히 문제의 약물이 어느 정도의 미토독성을 가지고 있을 때 약물 발견 노력을 위한 실행 가능한 옵션입니다. 중요하게도, Hoechst/PI 염색 분석체에 의해 얻은 결과는 분석이 다른 방법에 비교될 때 트라이판 블루 배제 결과 및 생물학적 복제 사이에 모두 증가된 일관성을 보여줍니다.

서론

효과적인 암 치료를 확인하는 첫 번째 단계는 치료의 효과를 검사하는 데 사용할 수있는 강력하고 편견없는 세포 독성 분석의 선택입니다. 낮은 처리량 실험에 대 한 일반적인 선택은 살아있는 세포에서 trypan 블루 염료의 제외. 이 방법은 세포 생존을 정량화하는 비교적 편견없는 방법을 허용하기 때문에 선호된다. trypan blue는 막이 손상된 세포로 수동적으로 확산되지만 건강한 세포^1을입력하는 것이 효과적으로 차단됩니다. 살아있는 세포와 총 세포의 몫은 치료의 효험을 나타내는 백분율 생존력을 나타냅니다. trypan 파란색 분석의 가장 중요한 단점은 높은 처리량 방법론에 적합하지 않다는 것입니다. 그것은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 있으며, 장기간 염색으로 인해 실행 가능한 세포의 얼룩으로 인해 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 따라서 trypan 파란색 제외는 일반적으로^2이며수동 계수로 강등됩니다. 이것은 너무 느리게 하고 연구원의 주관적인 판단으로 인한 편견의 강한 가능성을 소개합니다 (눈부신 또는 독립적 인 카운트가 사용되지 않는 한 실험실 처리량을 더 줄입니다). 일반적으로, 이 분석의 처리량은 현대 약 발견을 위해 불충분합니다.

일반....

프로토콜

1. 세포 독성 분석: 설정

1. 적절한 매체에서 원하는 농도로 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비한다(혈청 프리 또는 1, 2.5 또는 5% FBS RPMI-1640).
   1. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 (예를 들어, 효과적인 복용량을 결정하기 위해), 2 배 최종 농도에서 화합물을 준비.
   2. 화합물 조합의 세포 독성을 측정하려면 4배 의 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.
   3. 동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 예를 들어, DMSO 및 메탄올에 용해된 화합물을 테스트하는 경우 각 용매에 대한 용매 전용 제어를 합니다.
2. 배양 접시에서 세포를 수집하거나 15 mL 원추형 튜브로 플라스크합니다.
3. 10 μL 0.4% 트라이팬 블루로 셀 서스펜션 10μL을 마이크로센심분리기 튜브와 얼룩으로 옮기다. 혈종계를 사용하여 각 세포 소스에 대해 실행 가능한 셀과 실행 불가능한 세포를 계산합니다.
4. 펠릿 셀은 200 g에서 5 분 동안. 흡인 또는 열상.
5. 3*10⁵ 세포/mL의 세포 밀도에서 분석에 적합한 매체(혈청 프리 또는 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640)에서 세....

결과

전술한 프로토콜은 대표적인 급성 골수성 백혈병 세포주로서 취해진 OCI-AML2 세포를 사용하여 개발되었다. AML은^{골수(26)에서}미분화 및 비기능성 조혈 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. AML 표적 치료의 최근 발달에도 불구하고, 배려의 표준은 수십 년 동안 변경되지 않은 남아 있고, 유도 치료로 구성됩니다 (전형적으로 탄트라시클라인의 3 일, 예를 들면, daunorubicin, 이다루비신, 또는 탄트라네디온 미톡산 왕좌, 그리고 7 일간의 사이타라빈 의 다음) 그 다음에 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로^구성)다음 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로 구성) 다음 .

도 1A에설명된 프로토콜에 따라, OCI-AML2 세포는 96웰 플레이트에서 종자되어 미토콘드리아 단자 탄산마그네닐 시안화 m-클로로페닐.......

토론

Hoechst/PI 세포 독성 분석에 대한 프로토콜은 견고하고 비교적 작은 실습 시간이 필요하지만 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요한 몇 가지 실험 적 세부 사항이 있습니다. 첫째, DMSO의 농도가 0.5%(v/v) 이하로 유지되도록 하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 DMSO의 저용량에도 노출되면 세포의 형태와 부착을 실질적으로 변화시키고 세포 주기 진행을 크게 지연시킬 수 있다는 데^{동의된다39,40.}

둘째, 염색은 치료 후 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 세척 단계가 없기 때문에 화합물은 우물에 남아 있으며 세포에 손상을 계속 가할 수 있습니다. 이전^{프로토콜(35)에}비해, 세포는 단지 15분 동안 염색되었다. 이것은 실행 가능한 세포가 프로피듐 요오드로 실수로 얼룩질 수 있다는 가능성을 제한합니다. 이러한 이유로, 우리는 두.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-Deoxy-D-glucose/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-bromo-pyruvate	Alfa Aesar	1113-59-3
96-Well plates	Greiner Bio-One	655090	검은색 또는 투명한 평평한 바닥 96-well plates
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)	Thermo Fisher	A50101
Countess II 자동 세포 계수기	Thermo Fisher
Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 리더	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM 용액; 최종 농도 1:1,000
HyClone 소 태아 혈청	GE Healthcare	#25-514
m-chlorophenylhydrazone/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS 정제	Thermo Fisher	BP2944100	1정 + 멸균수 200mL = PBS 용액 1개
페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100X)	Gibco	10378016
Pierce LDH 분석 키트	Thermo Fisher	50-103-5952
프로피듐 요오드화물	Thermo Fisher	50-596-072	건조 분말; PBS에 1 mg/mL 저장; 최종 농도 5 &마이크로; g/mL (백혈병 세포), 1 & 마이크로; g/mL(일반 PBMC)
Rotenone	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 >	시그마 Aldrich	R8758-500ML
티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드	ACROS Organics	AC158990010
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
세포주
K562	ATCC	CCL-243	CML 세포주
MOLM-13	ATCC		AML 세포주
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	ALL 세포주
OCI-AML2	ATCC		AML 세포주