살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다

Natalie Biel; Lauren Figard; Anna Marie Sokac

doi:10.3791/61297

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방법 논문

살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다

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DOI:

10.3791/61297

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2020년 5월 15일

Natalie Biel¹^,² , Lauren Figard³ , Anna Marie Sokac¹^,²^,³

¹Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, ²Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 열 응력에 따라 살아있는 Drosophila 멜라노가스터 배아에서 조립되는 핵 액틴 막대를 시각화하는 것입니다. 액틴 로드는 신경 퇴행성 질환을 포함한 인간의 병리학과 함께 제공되는 보존되고 유도할 수 없는 액틴 스트레스 반응(ASR)의 특징입니다. 이전에, 우리는 ASR이 태아 발달의 형태 발생 실패 및 감소된 생존에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 이미징, 유전학 및 생화학에 매우 순종하는 모델 시스템에서 근본적인 actin 막대 조립 및 ASR 메커니즘의 지속적인 연구를 허용합니다. 배아는 주사를 준비하기 위해 커버슬립에 수집되고 장착됩니다. 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴(G-actin^Red)은희석되어 마이크로니들로 적재된다. 단일 주사는 각 태아의 중심으로 이루어집니다. 주사 후, 배아는 높은 온도에서 배양되고 핵 내 액틴 막대는 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화됩니다. 광표백 후형화 회복(FRAP) 실험은 액틴 봉상에서 수행될 수 있다; 및 세포질에 있는 그밖 액틴이 풍부한 구조물은 또한 심상일 수 있습니다. 우리는 G-actin^빨간 내인성 G-actin 같이 중합하고, 그 자체로, 일반적인 배아 발달을 방해하지 않는다는 것을 것을을 발견합니다. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 태아에 심각한 부상을 피하기 위해 주입 중에주의를 기울여야한다는 것입니다. 그러나, 연습으로, Drosophila 배아에 G-액틴^레드를 주입하는 것은 actin 막대를 시각화하는 빠르고 신뢰할 수있는 방법이며, 쉽게 어떤 유전자형의 파리또는 저산소증과 산화 스트레스를 포함한 다른 세포 스트레스의 도입과 함께 사용할 수 있습니다.

서론

이 프로토콜은 유도할 수 없는 액틴 응력 반응(ASR)^1을겪고 있는 열 응력 배아에서 핵액틴 봉의 조립을 시각화하기 위해 G-actin^Red를 주입하는 방법을 설명합니다. 우리는 배아에서 성기능 장애를 일으키고 생존력을 감소시키는 ASR의 연구를 돕기 위해 이 프로토콜을 개발했으며, 성인 인간 세포 유형은 신부전^2,근육 근병증^3,알츠하이머 및 헌팅턴병^4,^5,^6,^7,^8을포함한 병리와 관련이 있다. 이러한 ASR은 열 충격^9,^10,^11,산화 스트레스^4,^6,