방법 논문

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

DOI:

10.3791/61298

⸱

2020년 7월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포막 시스템에서 단백질 단백질 상호 작용은 세포간 상호 작용에서 신호 트랜스듀션에 이르기까지 광범위한 생물학적 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 환경 신호를 감지하는 것에서 생물학적 반응에 이르기까지; 신진 대사 조절에서 발달 제어에 이르기까지. 단백질-단백질 상호 작용의 정확한 구조 정보는 막 단백질 복합체의 분자 메커니즘을 이해하고 이러한 단백질을 조절하기 위해 매우 구체적인 분자의 설계에 매우 중요합니다. 생체 내 및 체외 접근법은 단백질 단백질 상호 작용의 검출 그리고 분석을 위해 개발되었습니다. 그 중 구조적 생물학 접근법은 원자 수준에서 단백질 단백질 상호 작용의 직접적인 구조적 정보를 제공할 수 있다는 점에서 독특합니다. 그러나, 현재 막 단백질 구조 생물학은 여전히 주로 세제 기반 방법으로 제한됩니다. 세제 기반 방법의 주요 단점은 그들의 네이티브 지질 이중층 환경이 세제 분자에 의해 제거되면 종종 해리 또는 변성 막 단백질 복합체이다. 우리는 막 단백질 구조 생물학을 위한 토착 세포막 나노입자 시스템을 개발하고 있습니다. 여기서, 우리는 AcrB의 올리고메황 상태의 사례 연구와 세포막에 단백질 단백질 상호 작용의 분석에 이 시스템의 사용을 보여줍니다.

서론

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단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 단백질의 구조와 기능의 유지에서 전체 시스템의 조절에 이르기까지 생물학 전반에 걸쳐 중추적 인 역할을합니다. PPI는 다양한 형태로 제공되며 형성되는 상호 작용 유형에 따라 분류될 수 있습니다. 이러한 분류중 하나는 상호작용이 동일한 하위 단위 또는 하위 단위로 작용하는 다른 단백질 사이의 여부에 따라 호모올리고메릭 또는 이종성고름입니다. 또 다른 분류는 상호 작용이 안정적인 복합체 또는 일시적인 복잡한 상태의 형성으로 이어지는 경우 상호 작용의 강도를 기반으로합니다. 단백질 간의 PPI에 대한 구조적 정보는 단백질이 기능을 수행하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 단백질의 80% 이상이 기능성 역할1을수행하기 위해 복잡한 형성에 의존하는 것으로 추정되고 있다. 생물학에서 그들의 중요성을 제대로 작동하기 위해 PPI에 의존하는 것으로 관찰된 단백질의 비율을 감안할 때, 그러나 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 제대로 조사 할 수 있다는 것은 단백질이 PPI를 형성할 때 실험적으로 관찰할 수 있는 기술의 제한으로 인해 도전적인 남아 있다.

많은 실험적으로 결정된 PPI에 대한 결과 사이에 는 높은 수준의 노이즈, 거짓 긍정 및 현재 사용 가능한 PPI 결정 기술의 많은에서 파생된 거짓 네거티브로 인해 높은 수준의 불일치가 있습니다. 이는 특히 효모 2하이브리드(Y2H) 시스템, 탠덤 친화정화질량 분광법(TAP-MS), 및 형광공명에너지전달(FRET)에 대해 PPI 결정2,3,4,5,6,7에가장 일반적으로 사용되는 세 가지 방법을 나타낸다. 이에 비해, 핵자기공명(NMR), X선 결정학 및 전자 현미경검사(EM)와 같은 단백질 구조 생물학 기술은 단백질-단백질 상호작용에 대한 고해상도 구조 정보를 원자 수준으로 끌어올리고 목표 단백질에 대한 직접적인 시각적 확인을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 현재 이용 가능한 비구조적 기반 PPI 결정 연구 기술(예를 들어, Y2H, TAP-MS 및 FRET)은 이러한 능력이 부족하고 단백질5사이의 약하고 일시적인 상호 작용을 식별하는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 단점은 적절한 사분위 구조와 이종복합 조립체의 형성에 영향을 미치는 지질 환경의 추가 변수에 의해 추가된 복잡성으로 인해 멤브레인 단백질을 연구할 때 더욱 강화된다.

막 단백질은 프로테아메의 큰 부분을 구성하고 모든 살아있는 유기체 내에서 작동하는 적절한 세포에서 많은 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. 멤브레인 단백질이 인간 게놈의 27%를 구성하고 모든 현재 약물 표적의 ~60%를 구성하는 것으로 추정되고 있음에도 불구하고 모든 발표된 단백질 구조의 ~2.2%를 구성하는 막 단백질에 대한 해결된 모델의 수에 큰 이상이 있다8,9,10. 구조적 정보의 가용성에 있는 불일치의 1 차적인 원인은 막 단백질 자체의 본질적인 속성에 있습니다. 열악한 용해도, 토착 구조 및 기능을 유지하기 위한 지질 환경과의 상호 작용에 대한 의존, 지질막 자체의 다양한 물리화학적 특성으로 인해 멤브레인 단백질은 이를 연구하기 위해 구조 생물학 기술을 구현할 때 상당한 문제를 계속 나타냅니다. 이러한 본질적인 특성 중 정확한 구조 정보를 얻는 데 가장 중요한 것은 자연적인 지질 환경과의 상호 작용이 기본 구조와 기능을 유지하는 요구 사항입니다. 지질환경은 멤테인의 개념(멤브레인과 단백질의 조합)이 멤테인의 개념과 기능의 구조 및 기능의 일체적인 부분으로, 막 단백질 구조 및기능(11)의기본 단위로 제안되었다. 지질 단백질 상호 작용의 중요성에도 불구하고 현재 사용 가능한 구조 기반 PPI 결정 기술은 종종 연구중인 단백질이 용해되거나 세제로 용해될 것을 요구합니다. 가혹한 세제에 노출은 단백질을 변성하거나 탈지때문에 거짓 긍정과 부정적인 원인이 될 수 있습니다, 이는 응집, 단백질의 거부, 비 공유 상호 작용의 해리, 인공 올리고머 상태의 형성을 유도할 수 있습니다. 본인의 골막 단백질의 정확한 측정을 위한 천연 지질 환경을 유지해야 하기 때문에, 이전에 보고된 스티렌 말레산 지질 입자(SMALP)13 방법에 기초하여 네이티브 세포막 나노입자 시스템(NCMNs)12를 개발하였다.

SMALP는 막 활성 폴리머로서 스티렌 남성산 합분자를 사용하여 막 단백질을 추출하고 용해시킵니다. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA)는 소수성 스티렌 폭정과 정반대의 성수성 남성산 폭정으로 인하여 독특한 수륙양용 폴리머입니다. pH 의존식메커니즘(14)에서세포막을 흡착, 불안정화 및 방해함으로써 나노입자를 형성한다. SMA의 이러한 기능적 활성은 막 단백질 추출 및 용윤화를 위한 세제 없는 시스템으로 활용할 수 있게 해줍니다. NCMN 시스템은 여러 측면에서 SMALP 시스템과 구별됩니다. NCMN 시스템의 가장 독특한 특징은 안정성과 네이티브 기능을 위해 다른 조건을 필요로 하는 많은 다른 멤브레인 단백질의 분리에 적합한 독특한 특성을 갖는 다수의 폴리머를 가진 멤브레인 활성 폴리머 라이브러리를 가지고 있다는 것입니다. NCMN 시스템은 또한 나노 입자를 제조할 때 SMALP 방법에 비해 다른 프로토콜을 갖는다. 이러한 예 중 하나는 NCMN이 고해상도 구조 결정에 대한 단일 단계 니켈 친화성 컬럼 정제를 사용한다는 것입니다. 이러한 상이한 프로토콜의 효과는 3.2 및 3.0 Å 극저온-EM AcrB 구조를 생성한 NCMNs 프로토콜을 비교할 때 관찰될 수 있으며, SMALP 방법을 이용한 유사한 연구와 함께 8.8 Å 해상도12,15에서극저온-EM AcrB 구조를 초래하였다. NCMN 시스템의 이러한 독특한 기능은 이전에 설립 된 SMALP 방법에 대한 개선이며 PPI 연구에 이상적인 후보입니다.

다중 약물 efflux 수송기 AcrB는 대장균12에서기능적 균질트리머로 존재한다. 돌연변이 분석은 AcrB 트리머의 안정성을 담당하는 루프에 위치한 단일 P223G 점 돌연변이가 트리머 상태를 불안정하게 하고, 제지 DDM으로 제조할 때 AcrB 단조량을 산출하는 것으로 제안되었으며, 이는 네이티브 블루 젤전광전지질(16)으로검출될 수 있다. 그러나, AcrB-P223G 돌연변이의 FRET 분석은 네이티브 세포막 지질 이중층 환경에서, 돌연변이 AcrB-P223G의 대다수가 여전히 트리머로 존재하고 야생 형 AcrB 및 AcrB-P223G 모두에 대한 발현 수준이 유사하다는 것을 건의했다. 그러나 FRET 분석 결과에도 불구하고, 돌연변이 수송기의 활동 분석은 야생 형16에비해 활동이 극적으로 감소하는 것으로 나타났다. FRET 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 분석을위해 널리 사용되고 있지만, 연구에 따르면17,18,19,20의거짓 긍정을 자주 줄 수 있는 것으로 나타났습니다.

최근에는 AcrB 트리머의 고해상도 극저온-EM 구조가 NCMNs12의사용을 통해 관련 토종 세포막 지질 이중층과 AcrB의 상호작용을 보여 주었다. 원칙적으로, NCMNs는 네이티브 세포막에서 발견되는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위해 쉽게 활용될 수 있다. 본 시스템의 시험에서, 본래 세포막 나노입자 및 음의 염색 전자 현미경검사를 사용하여 AcrB-P223G의 올리고메황 상태를 직접 관찰하기 위한 실험이 수행되었다. 야생형 AcrB 나노입자와 비교하기 위해, NCMN 라이브러리에서 NCMNP1-1로 인덱싱된 동일한 멤브레인 활성 폴리머(SMA2000)를 사용했으며, NCMN라이브러리(12)에서발견되는 대체 폴리머의 고해상도 극저온-EM 구조 판정에 사용하였다. 이전에 보고된 결과에 기초하여, AcrB-P223G 돌연변이의 대다수가 트리메릭 네이티브 세포막나노입자(21)의형태로 존재할 것으로 예상되었다. 그러나, 야생형 AcrB로 관찰된 것과 같은 샘플에는 AcrB 트리머가 발견되지 않았다. 이것은 AcrB-P223G의 대다수가 이전에 제안된 대로 네이티브 세포막에 트리머를 형성하지 않는다는 것을 건의합니다.

여기서 우리는 NCMN을 사용하여 야생 형 대장균 AcrB와 비교하여 돌연변이 대장균 AcrB-P223G의 상세한 분석을 보고합니다. AcrB의 이 사례 연구는 NCMNs가 단백질 단백질 상호 작용 분석을 위한 좋은 시스템임을 시사합니다.

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프로토콜

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1. 단백질 발현

  1. BL21(DE3) pLysS 세포를 함유한 플라스미드에 특화된 항생제로 15mL의 접종을 접종하여 250rpm에서 37°C에서 밤새 50mL 튜브에서 플라스미드를 발현하는 AcrB를 함유하고 있다.
  2. 600nm(OD 600)에서 야간배양의 광학 밀도를 확인하고 2.0을 초과하여 있는지 확인하십시오.
  3. 5mL의 세포 배양을 플라스미드에 특이적 항생제를 함유하고 37°C에서 배양한 후 OD600=0.8까지흔들어 서 최종 농도가 1mM인 IPTG로 유도한다.
  4. 20°C에서 20시간 동안 흔들림을 수행합니다.
  5. 4°C및 4,000 x g에서15분 동안 원심분리를 사용하여 세포를 아래로 펠릿다운.

2. 세포 리시스 및 막 격리

  1. 완충A에서 셀 펠릿을 다시 일시중지(표 1, 다음의 정화 방식에 따라 DDM 버퍼 A 또는 NCMNs 버퍼 A를 사용)은 셀 펠릿의 매 20g당 80mL를 사용합니다.
  2. 4°C에서 유리 두스 균질화제를 사용하거나 실온에서 얼음에 즉시 넣어야 하는 경우, 재중단된 세포 펠릿을 균질화한다.
  3. 샘플을 얼음에 금속 비커로 옮기고 4°C 및 1,500bar의 고압 균질화로 하여 세포를 용인합니다.
    1. 균질화로 세포를 로드하고 3-4 주기 또는 lysate가 명확히하기 시작할 때까지 균질화기를 통과할 수 있도록하는 과정을 반복하십시오.
  4. 4°C에서 30분 동안 15,000 x g의 리세스유 원심분리기.
  5. 4°C에서 1시간 동안 215,000 x g에서 초원심분리기 튜브 및 원심분리기로 상피물을 수집하고 부하를 채취합니다.
  6. 상체를 버리고 초원심분리기 튜브에서 멤브레인 펠릿을 수집합니다. -80°C에 초과 멤브레인 펠릿을 보관하십시오.

3. 네이티브 세포막 나노 입자의 준비

  1. 10mL NCMNs 버퍼A(표 1)에서멤브레인 펠릿 1g을 재연한다.
  2. 20°C에서 유리 두스 균질화로 재중단된 세포막 샘플을 균질화한다.
  3. 일시 중단된 멤브레인 샘플을 50mL 폴리프로필렌 튜브로 이송하고 멤브레인 활성 폴리머 스톡 용액및 추가 NCMNs 버퍼 A를 추가하여 샘플을 2.5%(w/v) 멤브레인 활성 폴리머(NCMNP1-1 또는 NCMNP5-2)의 최종 농도로 이시료를 유도한다.
    참고: 멤브레인 활성 폴리머의 스톡 솔루션은 이중 증류수로 이루어져야 하며 다양한 농도로 보관할 수 있지만 일반적으로 10%(w/v)로 유지될 수 있습니다.
  4. 20°C에서 2시간 동안 샘플을 흔들어 주세요.
  5. 샘플을 초원심분리기에 적재하고 20°C에서 1시간 동안 150,000 x g에서 회전합니다.
  6. 샘플이 초원심분리되는 동안 NCMNs 버퍼 A의 25mL와 5mL Ni-NTA 컬럼을 평형하기 시작합니다.
  7. 초원심분리가 완료된 후 상체를 수집하고 주사기 펌프를 사용하여 0.5mL/min의 유량으로 실온에서 Ni-NTA 컬럼 5mL에 적재한다.
  8. 시스템을 완전히 플러시한 다음 열을 FPLC 기계에 연결하기에 충분한 NCMNs 버퍼 B(표 1)로빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 라인을 세척하십시오.
  9. 1mL/분의 유량으로 30mL의 NCMN 버퍼 B로 컬럼을 세척하고 흐름을 수집합니다.
  10. 1mL/min의 유량으로 30mL의 NCMN 버퍼C(표 1)로컬럼을 세척하고 흐름을 수집합니다.
  11. NCMNs 버퍼D(표 1)의20mL를 유량으로 엘테우하고 분획 수집기와 각각 1.0mL로 설정된 분획을 사용하여 샘플을 수집한다.
  12. 단백질 샘플을 4°C에 저장합니다.
  13. FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 샘플을 확인하기 위해 SDS-PAGE 젤 전기전도 분석방법을 실행합니다.

4. SDS 페이지 젤 전기 전광

  1. 주조 장치에 유리를 클램핑하여 주조 챔버를 준비합니다.
  2. 표 1에나열된 레시피에 따라 12% 분리 젤을 준비한다.
    참고: TEMED가 첨가되면 젤이 빠르게 중합되므로 젤을 부어 줄 준비가 된 후에만 이 것을 추가합니다.
  3. 젤을 붓고, 스태킹 젤을 위해 빗 바닥 아래 2cm를 둡다.
  4. 젤 의 상부를 100% 이소프로판올로 겹쳐서 거품을 제거하고 분리 젤이 중합될 때까지 기다립니다.
  5. 이소프로판올을 제거하고 증류수로 이소프로파놀의 흔적을 씻어내라.
  6. 표 1에나열된 레시피에 따라 스태킹 젤을 준비한다.
    참고: TEMED가 첨가되면 젤이 빠르게 중합되므로 젤을 부어 줄 준비가 된 후에만 이 것을 추가합니다.
  7. 스태킹 젤을 분리 젤 위에 붓습니다.
  8. 우물을 형성하고 스태킹 젤이 완전히 중합 될 때까지 기다립니다 챔버에 빗을 추가합니다.
  9. 젤에서 실행해야 하는 각 분획 샘플에 대해 1M DTT의 1 μL을 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
  10. 각 튜브에 4배 로딩 버퍼7 μL을 추가합니다.
  11. 각 미세 원심 분리기 튜브에 젤에서 실행해야 하는 분획에서 20 μL의 샘플을 추가합니다.
  12. 샘플을 포함하는 튜브를 소용돌이.
  13. 3s용 탁상 미세원심분리기를 사용하여 샘플 튜브를 아래로 회전시키고 모든 샘플이 튜브 바닥으로 돌아왔는지 확인합니다.
  14. 12% 폴리아크릴아미드 젤 카세트를 제자리에 고정하고 트리스 아세테이트-EDTA(TAE)버퍼(표 1)로세포의 내부 및 외부 챔버를 채우어 젤 전기포고전지를 준비한다.
  15. 분자량 마커를 지침에 필요한 적절한 부피로 젤의 첫 번째 차선에 적재합니다.
  16. DTT및 적재 버퍼와 혼합된 각 튜브에서 샘플의 28 μL을 로드합니다.
  17. 전자전도 셀뚜껑을 상자 위에 놓고 뚜껑을 전원 공급 장치에 연결합니다.
  18. 전원 공급 장치를 켜고 100 V로 설정하고 20 분 동안 실행할 수 있습니다.
  19. 20분 후 전원 공급 전류를 140V로 늘리고 30-40분 동안 또는 로딩 버퍼 염료가 젤 카세트의 바닥에 도달할 때까지 계속 실행합니다.
  20. 전기 포진 얼룩을 완료 한 후 젤에 포함 된 단백질 밴드를 시각화 하는 젤을 염색 하 고 염색.

5. DDM을 이용한 단백질 정제

참고: 이러한 정제 공정을 수행하는 목적은 막 활성 중합체를 활용한 실험에 대한 제어 역할을 하는 것이다.

  1. 막 펠릿의 6-10 g를 다시 중단, 단계 에서 2.6, DDM 버퍼 A(표 1)막 펠릿의 5 mL/g를 사용 하 여.
  2. 4°C에서 유리 두스 균질화로 재중단 된 샘플을 균질화하거나 실온에서 즉시 얼음에 넣어해야합니다.
  3. 샘플을 50mL의 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 DDM 및 추가 DDM 버퍼 A를 추가하여 샘플을 2% DDM의 최종 농도로 가져옵니다.
  4. 4°C에서 2시간 동안 샘플을 흔들어 주세요.
  5. 샘플을 4°C 및 150,000 x g에서1시간 동안 초원심분리기 튜브 및 원심분리기에 적재합니다.
  6. 샘플이 초원심분리되는 동안 DDM 버퍼 A(표 1)의25 mL로 세척하여 Ni-NTA 컬럼의 5 mL을 준비하기 시작합니다.
  7. 초원심분리가 완료되면, 주사기 펌프를 사용하여 0.5mL/min의 유량으로 4°C에서 5mL Ni-NTA 컬럼에 상체를 수집하고 적재한다.
  8. 충분한 DDM 버퍼 B + 0.05 % DDM(표 1)로FPLC 라인을 세척하여 시스템을 완전히 플러시한 다음 열을 FPLC 기계에 연결합니다.
  9. 30mL의 DDM 버퍼 B + 0.05% DDM으로 컬럼을 1mL/min의 유량으로 세척하고 흐름을 수집합니다.
  10. 30mL의 DDM 버퍼 C + 0.05% DDM(표1)으로컬럼을 1mL/min의 유량으로 세척하고 흐름을 수집합니다.
  11. 20mL의 DDM 버퍼 D + 0.05% DDM(표1)을0.5mL/min의 유량으로 단백질을 엘테우트하고 분수 수집기를 사용하여 흐름을 수집하고 각 분획체와 분획을 각각 1.0 mL로 설정한다.
  12. 500 μL에 도달할 때까지 원심 농축기 및 원심 농축기를 4,000 x g 및 4°C에서 원심 기류를 사용하여 풀링 및 농축을 위해 용출 피크를 포함하는 분획을 선택합니다.
  13. 500 μL 루프를 사용하여 샘플을 FPLC 기계에 로드한 다음 4°C에서 25mL 크기 배제 열에 로드합니다. Elute는 30mL의 DDM 버퍼 E + 0.05% DDM(표1)을0.5mL/min의 유량으로 사용하고 분획당 0.5mL로 설정된 분획 크기로 분수 크기로 분수로 수집합니다.
  14. 280nm 흡광도를 사용하여 분획을 취하고 단백질 농도를 측정하여 FPLC 용출 그래프에서 UV-Vis 곡선을 확인합니다.
  15. FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 각 샘플 분획에서 20 μL을 수집하고 흡광도 테스트에 정확하도록 확인하였다.
  16. 원하는 알리쿼트에 액체 질소 또는 드라이 아이스를 사용하여 그 샘플 분획의 나머지부분을 동결하고 -80 °C에서 단백질 샘플을 저장합니다.
  17. 이전에 설명된 대로 SDS-PAGE 젤 전기전도 분석체를 실행하여 FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 샘플을 확인합니다.

6. 네거티브 얼룩 그리드 준비

  1. 탄소면이 위를 향하도록 필터 용지에 싸인 유리 슬라이드에 샘플 준비에 사용될 그리드를 놓습니다.
  2. 전자 현미경 그리드와 유리 슬라이드를 두 전극 사이에 광선 방전기의 챔버에 넣고 유리 뚜껑을 교체하여 중앙에 있고 잘 밀봉되었는지 확인합니다.
  3. 광선 방전 기계를 실행하고 플라즈마에 의해 생성 된 보라색 빛이 볼 수 있는지 확인합니다.
  4. 기계가 실행되면 챔버가 대기압에 도달하여 유리 뚜껑을 제거한 다음 그리드로 슬라이드를 다시 벤치로 돌려보내 샘플이 해당 에 로드될 때까지 기다립니다.
  5. 정제된 단백질 시료의 농도를 적절한 완충제로 희석하거나 원심 농축기를 사용하여 집중하여 약 0.1 mg/mL로 조정한다.
  6. 단백질 샘플의 3.5 μL을 10nm 두께의 탄소 그리드에 적재하고 1분 동안 기다립니다.
  7. 필터 용지로 EM 그리드 표면에서 액체를 제거합니다.
  8. 그리드로 3 μL 물방울을 집어 들고 각 액자를 집어 들기 사이에 필터 종이로 그리드에서 물을 제거하여 그리드 표면을 3배 세척합니다.
  9. 그리드 표면을 2x에 세척하여 3μL 의 신선하고 여과된 2% 우라늄 아세테이트를 집어 들고 각 액적을 집어 들기 사이에 필터 용지로 그리드의 세척 솔루션을 제거합니다.
  10. 1 분 동안 신선한, 필터링 2 % 우라늄 아세테이트의 3 μL 방울그리드 얼룩.
  11. 필터 용지로 EM 그리드 표면의 우라늄 아세테이트 용액을 제거하고 공기가 그리드를 최소 1분 동안 건조시합니다.
  12. 나중에 사용할 수 있는 그리드 상자에 그리드를 저장합니다.

7. EM 이미징

  1. 준비된 그리드를 안전한 작업벤치에서 그리드 홀더에 로드합니다.
  2. 현미경을 폴리스티렌 상자에 분해하여 현미경을 준비하고 액체 질소의 전체 분해 3/4을 채웁니다.
  3. 현미경 창의 고무 덮개가 그것을 덮고 있는지 확인한 다음 플랫폼에 맞을 때까지 구리 와이어를 탈전쟁에 배치하여 현미경에 탈장하는 것을 확인합니다.
  4. 데워의 나머지 부분을 액체 질소로 채우고 그것을 덮기 위해 데워 위에 캡을 놓습니다.
  5. 높은 장력을 켜고 현미경을 조건으로 하며 현미경이 워밍업되어 사용하기 위한 안전한 진공 수준을 확립할 때까지 기다립니다.
  6. 현미경이 준비되면 컬럼 밸브를 열고 현미경 창에 고무 커버를 제거하여 빔이 존재하는지 확인합니다.
  7. 빔의 강도를 조정하여 빔 의 강도를 배분하여 빔 낙인을 확인하십시오. 난시가 존재하는 경우 빔은 교차에서 멀리 이동하고 빔은 양쪽에 동일한 타원형 모양이어야할 때 타원형 모양을해야합니다.
  8. 현미경 쌍안경을 관찰자의 눈에 따라 올바른 높이와 거리로 조정합니다.
  9. 빔이 각각 중심이 될 때까지 세 가지 모드를 모두 순환하여 검색, 초점및 노출 모드를 위한 빔 위치를 확인합니다.
  10. 컬럼 밸브를 닫고 그리드 홀더를 전자 현미경에 로드합니다.
  11. 현미경을 사용하여 현미경을 우심 높이로 조정하고 중앙에 있는 샘플의 좌우 움직임이 없을 때까지 Z축을 사용하여 단계의 움직임을 조정한다.
  12. 현미경에 저용량 검색 모드를 사용하여 샘플에 초점을 맞출 존재하는 샘플 분자와 합리적인 대조의 바람직한 영역에 대한 그리드를 검색합니다.
  13. 샘플이 보일 때까지 높은 단계 크기를 사용하여 Focus 모드의 샘플에 초점을 맞춘 다음 단계를 줄여 올바른 초점 수준을 찾습니다.
  14. 0 및 빔을 블랭크 한 다음 고무 패드가 현미경 창을 덮고 있는지 확인하십시오.
  15. 노출 모드를 사용하여 원하는 그리드 영역의 이미지를 사용하여 62,000배배율로 1s 노출을 하고 획득한 이미지를 확인합니다.
  16. 이미징을 수행하면 그리드가 컬럼 밸브를 닫고 기둥에서 그리드 홀더를 제거합니다.
  17. 이미징을 완료하면 관심의 모든 그리드가 필라멘트 전력을 끄고 현미경에서 액체 질소 분해를 제거하여 현미경을 종료합니다.
  18. 현미경의 구리 코일에서 응축을 잡기 위해 데워가 앉아 스탠드에 수분을 흡수할 수 있는 무언가를 놓습니다.
  19. Cryo 주기 모드를 활성화하고 터보 펌프가 꺼져 있는지 확인합니다.

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결과

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여기에 제시된 절차를 사용하여 대장균 AcrB 야생형 과 대장균 돌연변이 AcrB-P223G 샘플을 정제하였다. 샘플은 그 때 탄소 음성 얼룩 전자 현미경 검사기격자에 흡착하고 측면 블로팅방법(22)을가진 우란 아세테이트를 사용하여 염색하였다. 음의 얼룩 이미지는 투과 전자 현미경 검사를 사용하여 수집되었다. DDM으로 정제된 AcrB 야생형 시료에 대한 음의 얼룩 이미지는 단백질이 잘 정의된 트리메황 사분위 구조를 나타내는 단백질을 가진 단분산 입자의 균일한 용액을나타낸다(도 1A). 이러한 트리메릭 구조는 정제시 관찰된 크기 배제 크로마토그램에대응한다(보충도 1). 이에 비해, AcrB-P223G 돌연변이에 대한 네거티브 얼룩 영상을 볼 때, DDM으로 정제된, 다분산 나노입자의 이질적 용액을 관찰할 수 있으나 관찰가능한 네이티브 트리머(그림

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토론

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단백질 단백질 상호 작용은 막 단백질의 구조와 기능의 무결성에 중요합니다. 많은 접근은 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 개발되었습니다. 수용성 단백질과 비교할 때 막 단백질과 PPI는 막 단백질의 독특한 본질적인 특성으로 인해 연구하기가 더 어렵습니다. 이 어려움은 주로 구조적 안정성과 기능을 위해 토착 지질 이중층 환경에 내장될 막 단백질의 요구 사항에서 비롯됩니다. 단백질의 고해상도 구조를 결정하기 위해서는 세포막에서 추출해야 하기 때문에 문제가 됩니다. FRET는 세포막에 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 인기있는 기술이지만, 해상도가 낮고 자주 거짓 긍정17,18,19,20을생성한다. 여기서 처음으로 NCMN은 네이티브 세포막에서 야생형 AcrB 트리머 및 AcrB-P223G 단조근...

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공개 사항

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Y.G는 막 활성 폴리머 NCMNP5-2 및 NCMN 시스템의 발명가로 나열된다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 VCU 스타트업 기금 (Y.G.)과 국립 보건 원의 국립 의학 연구소에 의해 지원되었다 수상 번호 R01GM132329 (Y.G.에) 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 몬세라트 삼소와 케빈 맥로버츠가 비디오 녹화에 대한 후원을 아끼지 해 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals
30% 아크릴아미드/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (로딩 버퍼)Bio-Rad1610747
Acetic Acid GlacialThermoFisher ScientificA38S-212
과황산암모늄(APS)Bio-Rad161-0700
클로람페니콜GoldbioC-105-5
Coomassie, Brilliant Blue, R-250, 단백질, 염색 분말Bio-Rad161-0400
DTT(디티오트레이톨)(>, 99% 순수), 프로테아제 무함유GoldbioDTT10
글리세롤ThermoFisher ScientificG33-4
HEPES,ThermoFisher ScientificBP310-1
이미다졸Affymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycinGoldbioK-120-25
염화마그네슘 육수화물ThermoFisher ScientificAA3622636
메탄올ThermoFisher ScientificA412-4
N,N-디메틸에틸렌디아민(EDTA)머크8.03779.0100
NCMNS-P5-2Notavailable
obtaining in author Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray Valley신저자
염화나트륨ThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Uranyl AcetateAmbinter AmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
탄소 전자 현미경 그리드 (10 nm)전자 현미경 과학CF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue HomogenizerEberbachE7265
코닝 LSE 미니 마이크로 원심분리기ThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
분획 수집기 F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀Bio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 분광 광도계ThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K 초원심분리기Beckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue GrinderWheaton358013
PowerPac 기본 전원 공급 장치Bio-Rad164-5050
Razel R99-E 가변 속도 주사기 펌프Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti 고정각 로터Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml 원추형 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml 컬럼GE 헬스케어 생명 과학17524802
pET-24aEMD 생명과학69749-3
, , , , , , , commercial yet submit obtaining 교에 획득 요청서 제출

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