여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 > 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
신장 병은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치고 연방 지출에 수십억 달러의 비용이 듭니다. 신장 질환과 최종 말기 신부전의 가장 심각한 형태는 종종 신장의 여과 장벽을 형성하기 위해 내피 세포 및 구체 지하실 막과 함께 작동하는 고도로 전문화 된 상피 세포인 구체 포도세포의 손상에 의해 발생합니다. 신장 의학의 발전은 1 차 조직의 제한된 가용성과 podocytes와 같은 기능적인 인간 신장 세포의 파생을 위한 강력한 방법의 부족에 의해 방해되었습니다. 줄기 세포와 같은 재생 가능한 소스에서 podocytes를 파생하는 기능은 인간 신장 발달 및 질병의 기계장치의 현재 이해를 발전시키는 것을 도울 뿐만 아니라 치료 발견을 위한 새로운 공구를 제공할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 목표는 고효율 및 특이성을 가진 인간 유도만능 줄기 (hiPS) 세포로부터 성숙하고 미토성 후 podocytes를 추출하고 화학적으로 정의된 조건하에서 도출하는 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 방법에 의해 생성된 hiPS 세포 유래 podocytes는 혈통 특이적 마커(nephrin, podocin 및 Wilm의 종양 1 포함)를 발현하고 성숙하고 기능적인 podocytes와 관련된 특수형태특성(1차 및 이차 발 프로세스 포함)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 특수 특징은 특히 현장에서 널리 사용되는 불멸의 podocyte 세포주에서 결석하며, 이는 본원에 기술된 프로토콜이 기존의 podocyte 세포주보다 발달적으로 더 성숙한 표현형을 갖는 인간 신장 podocytes를 생산한다는 것을 시사한다.
서론
인간 만능 줄기 세포 배양의 발전은 연구자들이인체내거의 모든 세포 유형을 얻기 위해 설계될 수 있는 생물학적 물질의 재생 가능하고 확장 가능한 근원을 제공함으로써 재생 의학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 혁명을 일으킬 태세입니다. 이 전략은 그렇지 않으면 얻기 어려울 전문적이고 기능적인 세포 유형을 유도하는 데 특히 유용합니다. 인간 유도만능 줄기(hiPS) 세포2,3,4,5는 그들의 체세포 기원 과 개인화된 의학을 대변하는 잠재력 때문에 특히 매력적이다. 그러나, hiPS 세포로부터 다른 세포 혈통을 유도하는 방법을 개발하는 방법은 낮은 효율과 비특이적 세대의 이종세포 집단을 유도하는 제대로 정의된 배양 조건의 빈번한 사용으로 인해 여전히 어려운 남아 있다6,7.
여기에 제시된 화학적으로 정의된 조건하에서 특이성과 고효율을 가진 hiPS 세포로부터 성숙한 신장 세포....
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프로토콜
1. 시약 준비
- 희석 해동 5x hiPS 세포 배양 매체 (CCM) hiPS 세포 배양 기저 배지에 보충 hiPS CCM의 1 x 용액을 얻을 수 있습니다.
참고 : 냉동 5x hiPS CCM 보충은 하룻밤 동안 이상적으로 4 ° C에서 느린 해동 과정이 필요합니다. 1x hiPS CCM의 알리쿼트(Aliquots)는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다. - hiPS 세포 배양을 위한 지하 막(BM) 매트릭스 1코팅 판의 준비: 4°C에서 얼음에 하룻밤 을 해동 BM 매트릭스 1. 해동되면 제조업체에서 제안한 적절한 희석 요인으로 알리쿼트를 준비하십시오.
참고: 일반적으로 알리쿼트(aliquots)는 50mL 원추형 튜브에서 25mL의 콜드 DMEM/F12에서 후속 희석을 위해 준비된 다음 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 피하기 위해 철저한 혼합을 한다. - BM 매트릭스 1용액의 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 전송하고 37°C에서 1-2h 또는 4°C에서 파라핀 필름으로 싸서. BM 매트릭스 1-코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C로 저장할 수 있다.
- 지하 멤브레인 (BM) 매트릭스 2 - 코팅 플레이트의 준비 : 5 μg / mL의 최종 농도를 준비하기 위해 9 mL 멸균 ....
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결과
이 프로토콜의 목표는 성숙한 인간 podocytes가 화학적으로 정의된 조건의 밑에 hiPS 세포에서 파생될 수 있다는 것을 보여주기 위한 것이었습니다. 본 원고에 제시된 데이터는 처음 테스트된 DU11 hiPS세포주(17)를사용하여 생성되었으며, 마이코플라즈마가 없는 것으로 나타났다. 염색체 분석도 수행되었고, 세포는 karyo전상정상인 것으로 나타났다. 미분화 DU11 hiPS 세포를 시작으로, 본 보고서에 설명된 분화전략(도 1)은먼저 브라추리를 발현하는 중피 세포로 줄기세포(도2A)를분화하기 위해 채택되었다(도 1B 및 도 2B),PAX2 양성 중형 메소더름세포(도 2C), 및 마지막으로 성숙신장발구체(도 2C)로 분화한 후, 신장 발구체(그림
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토론
이 보고에서는, 우리는 hiPS 세포에서 신장 구엽 포도세포의 생성을 위한 프로토콜을 기술합니다. hiPS 세포 유래 podocytes는 성숙한 신장 podocyte 표현형(13)과관련된 형태학적 및 분자 특징을 나타낸다. 이전 간행물에서, 우리는 hiPS 세포 유래 podocytes가 구체 미생물 혈관 내피 세포와 결합할 때 신장 구체 구체세포의 구조 및 선택적 여과 기능을 모방할 수 있음을 보여주었다8,11.
다음 중요한 단계는 이 프로토콜을 조정하는 데 관심이 있는 연구원들에 의해 고려되어야 합니다. 첫째, 중피 세포의 유도를 위해 라미닌 코팅 플레이트에 hiPS 세포의 파종은 중요한 단계이다. 100,000 개의 세포 / 우물의 파종 밀도가 권장되는 반면, 연구원은 연구에 사용되는 줄기 세포주의 복제 속도에 따라 초기 세포 파.......
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공개 사항
S.M. 만능 줄기 세포에서 신장 podocytes의 생성을 위한 방법에 대한 특허 출원에 대한 저자입니다 (미국 특허 출원 14/950859). 나머지 저자는 경쟁 적인 관심사가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 듀크 대학의 공학의 프랫 학교, 듀크 의과 대학의 신장학 부문, 듀크 대학의 의과 대학에서 의자 연구 상, 그리고 S.M버로우 웰스 웰컴 펀드 PDEP 경력 전환 애드 호크 상에 의해 지원되었다. M.B국립과학재단의 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 우리는 DU11 줄기 세포주를 아낌없이 우리에게 제공 버삭 연구소, 일시적으로 우리의 그룹과 자신의 조직 문화 시설을 공유 듀크 대학의 Varghese 연구소에 감사드립니다. 이 출판물은 그녀의 60번째 생일을 축하하기 위해 매사추세츠 공과 대학의 노바티스 화학 교수 인 로라 L. 키슬링 교수에게 헌정되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | DU11(Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke University iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 마이코플라스마에 대해 테스트되었으며 2019년 7월 우리 실험실에서 마지막으로 핵형 분석을 받았으며 핵형 정상으로 판명되었습니다. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 무혈청 보충제 | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | 로트간 변동을 보일 수 있음 |
| CultureBoost-R | 이 포함된 완전한 배지 키트4Z0-500-R | 세포 시스템 | Podocyte 유지 관리 매체 |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| GlutaMAX 보충제가 포함된 DMEM/F12 | 10565042 | Thermo/Life Technologies | 글루타민 보충제가 포함된 DMEM/F12 |
| 열 비활성화 FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life 기술 | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 매체 | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS 세포 배양 매체 (CCM) |
| Penicillin– 스트렙토마이신, 액상 (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK 억제제 | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– 및 Alexa Fluor 594– 접합 2차 항체 | A32744; A32754입니다. A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5-mL 바이알 | 354277 | BD 생명과학 | 기저막(BM) 매트릭스 1. 로트-투-로트(lot-to-lot) 변이 |
| <강>효소 및 기타 시약 | |||
| 아큐타아 | A1110501 | 있음: Thermo/Life Technologies | 세포 박리 용액 |
| BSA | A9418 | 시그마-알드리치 | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | D2438 | 시그마-알드리치 | DMSO는 독성이 있습니다. 화학 물질 안전 후드에서 취급해야 합니다 |
| 효소가 없는 세포 해리 완충액, Hank' s 균형 잡힌 염 | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| 에탄올 용액, 70%(vol/vol), 생명공학 등급 | 97065-058 | VWR | 에탄올은 가연성 및 독성이 있습니다 |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde(PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA는 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비와 함께 화학 흄 후드에서 취급해야 합니다. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| 멸균 증류수 | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| 흡입 피펫, 개별 포장 | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R 원심분리기 | B99516 | Beckman Coulter | |
| 원추형 원심분리기 튜브, 15 mL | 352097 Corning | ||
| 원추형 원심분리기 튜브, 50 mL | 352098 | Corning | |
| 극저온 상자 | 3395465 | Thermo/Life Technologies | 냉동 보관용 부분 표본 |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | 고정 및 염색된 iPS 세포 및 그 유도체의 이미지를 획득하는 데 사용되는 형광 현미경 |
| 혈구계 | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터 | 51030403 | Thermo/Life Technologies | iPS 세포 및 그 유도체 |
| 의 일상적인 배양 및 유지 관리AxioCam 503 카메라가 장착된 거꾸로 된 Zeiss Axio Observer | 491916-0001-000(현미경) ; 426558-0000-000(카메라) | Carl Zeiss Microscopy | podocyte 분화의 각 단계에서 살아있는 iPS 세포 및 그 유도체의 위상차 이미지를 획득하는 데 사용 |
| Kimberly-Clark 니트릴 장갑 | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, 대형 | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, 소형 | 21905-026 | VWR | |
| P10 정밀 배리어 피펫 팁 | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 배리어 피펫 팁 | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 배리어 피펫 팁 | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 배리어 피펫 팁 | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 배리어 피펫 팁 | P1122 | Denville Scientific | |
| 혈청학 피펫, 10mL, 개별 포장 | 356551 | Corning | |
| 혈청학 피펫, 25mL, 개별 포장 | 356525 | Corning | |
| Serological 피펫, 5mL, Corning | 356543 | ||
| , 0.22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| 멸균 마이크로 원심분리기 튜브 | 1138W14 | Thomas Scientific | 성장 인자 분취용 |
| 조직 배양– | Corning | ||
| Tissue culture&ndash 353043 처리된 12웰 플레이트; 처리 된 6 웰 플레이트 | 353046 | Corning | |
| VWR 화이트 techuni 랩 코트 | 10141-342 | VWR | |
| 와이드 베벨 셀 리프터 | 3008 | 코닝 |
참고문헌
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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