이 프로토콜은 설치류 뇌 샘플의 동일한 세트에서 허혈성 뇌 손상의 세 가지 가장 중요한 매개 변수를 측정하는 새로운 기술을 설명합니다. 하나의 뇌 샘플만 사용하는 것은 윤리적 및 경제적 비용 면에서 매우 유리합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인 중 하나는 허혈성 뇌졸중입니다. 역사적으로, 허혈성 뇌졸중을 자극하는 데 사용되는 동물 모델은 중간 뇌동맥 폐색(MCAO)을 포함한다. 경색 영역, 뇌 부종 및 혈액 뇌 장벽 (BBB) 고장은 MCAO 후 뇌 손상의 정도를 반영하는 매개 변수로 측정됩니다. 이 방법에 대한 중요한 제한은 이러한 측정이 일반적으로 다른 쥐 뇌 샘플에서 얻어져 적절한 샘플 크기에 대해 안락사해야 하는 많은 수의 쥐로 인해 윤리적 및 재정적 부담을 초래한다는 것입니다. 여기서 우리는 쥐 두뇌의 동일한 세트에서 경색 영역, 뇌 부종 및 BBB 투과성을 측정하여 MCAO 다음 뇌 손상을 정확하게 평가하는 방법을 제시합니다. 이 새로운 기술은 뇌졸중의 병리생리학을 평가하는 보다 효율적인 방법을 제공합니다.
서론
전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인 중 하나는 뇌졸중입니다. 전 세계적으로 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중 사례의 68%를 나타내며, 미국에서는 허혈성 뇌졸중이뇌졸중사례1,2의87%를 차지합니다. 미국의 뇌졸중 경제적 부담은 미국2억 4천만 달러, 유럽연합3에서450억 유로에 달하는 것으로 추산된다. 뇌졸중의 동물 모델은 병리 생리학을 연구하고, 평가를 위한 새로운 방법을 개발하고, 새로운 치료 옵션을 제안하기 위해 필요하다4.
허혈성 뇌졸중은 주요 뇌동맥의 폐색, 보통 중간 뇌동맥 또는 그 가지5중 하나를 다듬어 발생한다. 따라서, 허혈성 뇌졸중의 모델은 역사적으로 중뇌 동맥 폐색(MCAO)6, 7,8,9,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험동물 사용 지침에 따라 다음과 같은 절차가 진행되었습니다. 실험은 또한 네게브의 벤 구리온 대학에 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 실험 절차를 위해 쥐를 준비
- 300에서 350 g 사이 각 무게는 과잉 병리학 없이 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐를 선택합니다.
- 모든 쥐를 22°C의 실온에서 유지하며 실험 전에 12시간의 빛과 어두운 주기를 유지합니다.
- 음식과 물을 사용할 수 있는지 확인 합니다.
- 6:00 a.m 및 2:00 p.m 사이의 모든 절차를 수행합니다.
2. 수술을 위한 쥐 준비
- 이소플루란(in흡입은 4%, 유지보수2%)과 24%의 산소(1.5L/분)로 30분 동안 쥐를 마취시합니다.
- 그들은 페달 철수 반사가없는 보장하여 쥐의 마취 수준을 테스트합니다.
- 24 게이지 카테터를 꼬리 정맥에 삽입합니다.
참고: 혈관 확장을 위한 꼬리 온난화는 수행되지 않습니다.- 쥐를 테이블에 올려놓는 자세를 취합니다. 의료 용 테이프를 사용하여 쥐의 사지 네 마리를....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
비원지 측정
독립적인 견본 t-시험은 16개의 sham-작동 한 쥐에 비해 뇌 경색 볼륨의 상당한 증가를 입증 했다 19 쥐 표시 (MCAO=7.49% ± 3.57 대 샴 = 0.31% ± 1.9, t(28.49) = 7.56, p lt&01 (그림). 데이터는 SD에 ± 반대 반구의 평균 백분율로 표현됩니다.
뇌 부종 측정
독립적인 샘플 t-test는 영구 MCAO를 받은 19마리의 쥐가 16마리의 sham 조작 쥐(MCAO=12.31%± 8.6% ± 샴 = 0.64% ± 10.2, t(29.37) = 3.61, p.2=0.2(0.0)에 비해 24시간 후 뇌 부종의 정도가 현저한 증가를 보였다고.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 프로토콜의 주요 목표는 허혈성 상해의 세 가지 주요 매개 변수인 IZ, BE 및 BBB 투과성에 대한 일관된 측정을 입증하는 것이었습니다. 이 분야의 이전 연구는 동일한 샘플에서 이러한 매개 변수 중 하나 또는 두 개의 매개 변수를 함께 수행 할 가능성을 입증했습니다. 이 3부법이 제공하는 비용 절감 외에도, 또한 수술해야 하는 동물의 수를 제한하고 이후에 안락사해야 하는 보다 바람직한 생물학적 모델을 제공한다. 모든 조직학적 기술에서와 마찬가지로, 이 방법은 허혈성 손상을 동적으로 관찰할 수 없다는 것에 의해 제한됩니다.
이미지 분석에는 ImageJ 1.37v, 어도비 포토샵 CS2, 마이크로소프트 엑셀 365, IBM SPSS 통계 22의 네 가지 컴퓨터 프로그램이 사용되었습니다. ImageJ는 경색 영역과 뇌 부종의 확장을 측정하는 데 사용되었습니다. 어도비 포토샵은 파란색이 BBB 고장을 나타내기 때문에 에반스 블루가 뇌 조직에 미치는 영향을 제한하는 데 사용되었습니.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 메리나 쿠체리아바, 막심 크리보노소프, 다리나 야쿠멘코, 에브게니아 곤차릭 생리학과, 생물학 학부, 생태학 및 의학, 올레스 혼차르, 드니프로 대학, 드니프로, 우크라이나 에 대한 지원과 우리의 토론에 도움이 기여에 감사드립니다. 수집된 데이터는 루슬란 쿠츠 박사 학위 학위 의 일부입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 주사기 | Braun | 4606027V | |
| 70% 알코올 용액에 2% 클로르헥시딘 | Sigma-Aldrich | 500 cc | 수술 현장에서 피부의 일반적인 방부제 제공 |
| 사기 | Braun | 305620 | |
| 3-0 실크 봉합사 | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 나일론 봉합 | 4-00 | ||
| 브레인 & 조직 매트릭스 | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | ||
| 원심분리기 Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| 소형 분석 저울 | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| 디지털 저울 | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| 해부 가위 | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf 피펫 | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| 형광 검출기 | Tecan, Mä nnedorf 스위스 | 모델: Infinite 200 PRO 다중 모드 리더 | 옵션. |
| 형광 검출기 | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader 기본 기기 | 옵션. |
| 거즈 스폰지 | Fisher | 22-362-178 | |
| 온도계가 있는 히터 | Heatingpad-1 | 모델: HEATINGPAD-1/2 | |
| 지혈 마이크로클립 | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| 주입 커프 | ABN | IC-500 | |
| 마이크로 펜치 | Sigma-Aldrich | ||
| 마이크로 가위 | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 현미경 | 올림푸스 | ||
| 작동 겸자 | Sigma-Aldrich | ||
| 작동 가위 | Sigma-Aldrich | ||
| 광학 스캐너 | Canon | Cano Scan 4200F | 해상도 3200 x 6400 dpi |
| 페트리 접시 | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | 쥐, 생쥐 및 햄스터에게 주어진 설치류 실험실 차우는 5 년 이상 생물 의학 연구에 사용되어온 수명주기 영양입니다. 이 실험에서 쥐에게 자유로이 제공되었습니다. |
| 쥐 케이지 | Techniplast | 2000P | 설치류를 위한 기존 하우징. 실험 내내 쥐를 수용하는 데 케이지가 사용되었습니다: |
| 메스 블레이드 #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe | |||
| ImageJ 1.37v | NIH | 소스 코드는 무료로 사용할 수 있습니다. 저자인 Wayne Rasband(wayne@codon.nih.gov)는 미국 메릴랜드주 베데스다에 있는 National Institute of Mental Health의 Research Services Branch에 있습니다 | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft-Microsoft | Office Excel | |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 | 시그마-알드리치 | 298-96-4 | |
| 50% 트리클로로아세트산 | 시그마-알드리치 | 76-03-9 | |
| 에탄올 96 % | 로마형 | 가연성 액체 | |
| 에반스 블루 2% | 시그마-알드리치 | 314-13-6 | |
| 이소플루란, USP 100% | 피라마말 크리티컬 케어, Inc | NDC 66794-017 |
참고문헌
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
