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방법 논문

야누스 베이스 나노튜브와 줄기 세포 접착을 위한 섬유네틴을 갖춘 바이오미메틱 나노 매트릭스의 제조

3.4K 조회수

DOI:

10.3791/61317

2020년 5월 10일

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)을 가진 생물미메틱 나노매트릭스(NM)의 조립을 보여주는 것이다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)와 공동 배양할 때, NM은 hMSCs 접착을 장려하는 우수한 생체 활성을 나타낸다.

초록

생체 모방 NM은 줄기 세포 앵커리지를 향상시킬 수 있는 조직 공학 생물학적 스캐폴드로 개발되었습니다. 생체 모방 NM은 수성 용액의 자체 조립을 통해 JBNT및 FN에서 형성됩니다. JBNT는 내부 소수성 중공 채널과 외부 친성 성 표면으로 길이 200-300 μm을 측정합니다. JBNT는 양수 충전되며 FN은 음수 로 충전됩니다. 따라서 중립 수성 용액에 주입하면 비일관성 결합을 통해 결합되어 NM 번들을 형성합니다. 자체 조립 공정은 화학 개시기, 열원 또는 자외선 없이 몇 초 이내에 완료됩니다. NM 솔루션의 pH가 FN(pI 5.5-6.0)의 등광점보다 낮으면, NM 번들은 양전하 FN의 존재로 인해 자체 방출됩니다.

NM은 세포외 매트릭스 (ECM)를 형태학적으로 모방하는 것으로 알려져 있으므로 hMSC 접착력을 향상시키는 우수한 플랫폼을 제공하는 주사용 스캐폴드로 사용할 수 있습니다. 세포 밀도 분석 및 형광 이미징 실험은 NM이 음의 대조군과 비교하여 hMSC의 앵커리지를 크게 증가시켰다는 것을 나타냈다.

서론

인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 조직1의재생 및 유지에 도움이 되는 다른 중간엽 혈통을 따라 자가 재생 및 자가 분화의 잠재력을 보여주었습니다. 분화 잠재력에 기초하여, hMSC는 중간 엽 조직 상해 및 조혈 장애 치료2에대한 후보로 간주됩니다. hMSC는 조직 수리, 혈관 신생, 염증 감소3을증가시켜 상처 치유를 촉진하는 능력을 보여주었습니다. 그러나 생화학적 또는 생체 재료 의 지원 없이, hMSC가 표적 조직에 도달하고 원하는 위치에서 기능하는 효율은 낮다4. 병변을 고수하기 위해 hMSC를 유치하기 위해 다양한 엔지니어링 스캐폴드가 활용되었지만, 긴 뼈 의 중간에 있는 성장판 골절과 같은 일부 부위는 기존의 사전 제작 된 비계로 쉽게 접근 할 수 없으며 불규칙한 모양의 부상 부위에 완벽하게 맞지 않을 수 있습니다.

여기서, 우리는 그 자리에서 스스로 조립하고 표적 영역에 도달하기 어려운 주입할 수 있는 생체 모방 나노 물질을 개발했습니다. 주사용 바이오 스캐폴드 NM은 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)으로 구성된다. 또한 로제트 나노 튜브 (RNT....

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프로토콜

1. JBNT의 합성

참고 : JBNT 단조량은 이전에 출판 된 대로 준비되었다11.

  1. 화합물 A1의 합성
    1. 톨루엔 25mL및 N-디메틸포르미드의 2.5mL에서 8.50g의 시아노아세이스틱산과 9.80 g의 에틸카르바메이트를 함유한 용액을 준비한다. 4.90mL의 인산화를 드롭와이즈로 넣습니다. 그런 다음 혼합물을 70 °C로 가열하고 1.5 시간 동안 계속 저어줍니다.
    2. 반응 혼합물을 실온으로 식히고 얼음 물 100g을 붓습니다. 에틸 아세테이트(3 x 250mL)로 수성 층을 추출하고 100mL의 소금물로 세척합니다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 옅은 노란색 고체를 얻습니다.
    3. 노란 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(3% 메탄올/디클로로메탄)를 주체하여 백색 분말로서 화합물 A1의 15.61g을 산출한다.
  2. 화합물 A2의 합성
    1. 화합물 A1 3.12 g와 탄산칼륨 2.75 g를 N, N-디메틸포르마미드의 50mL에 섞는다. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다.
    2. 반응 현탁액에 2.6mL의 탄소 ....

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결과

우리의 연구는 JBNT와 FN의 NM의 형성이 빠르다는 것을 것을을 발견했습니다, 이는 10 초에 일어났습니다. 도 2에도시된 바와 같이, JBNT 용액이 FN 용액과 혼합되고 여러 번 배관되었을 때 백색 플록을 얻었다. NM의 형성 과정은 완전히 생물모방이다. 외부 자극이 필요하지 않습니다. 제조 과정은13을교차연결하기 위한 자외선 또는 화학 개시자를 기반으로 하는 일부 신흥 생체 재료보다 훨씬 쉽습니다.

FN, JBNT, NM(그림3)의카메라 이미지를 캡처하고 분석했습니다. FN 군의 경우 짧은 백색 반점을 제외하고는 긴 섬유가 관찰되지 않았다. 짧은 클러스터는 FN으로 구성된 단백질 응집체였으며, 이는 JBNT(그림3A)없이는FN만으로는 스캐폴드 구조를 형성할 수 없음을 나.......

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토론

이 연구에서는 DNA에서 영감을 얻은 JBNT와 FN으로 형성된 자체 조립 된 생체 Mimetic NM을 개발했습니다. JBNT 용액을 준비할 때, PBS가 조립을 억제하는 JBNT의 응집을 유발하기 때문에 JBNT 리오필화 분말은 PBS 대신 물에 용해되어야 합니다. 또한, NM은 PBS의 염이 NM 섬유와 번들되기 때문에 NM의 나노 피브릴 구조를 관찰하려는 경우에도 물로 조립되어야 하며, 이는 이미지의 해상도를 크게 감소시킬 수 있다.

NM은 hMSCs 접착 및 분화를 용이하게하는 데 사용 된 조직 재생 비계를 제조하기 위해 많은 노력이 이루어졌지만 새로운 조직 공학 발판으로 봉사 할 수있는 큰 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, 이러한 물질의 대부분은 3D 프린팅 스캐폴드18,19와같은 특정 형상으로 미리 만들어집니다. 따라서 관절 깊숙이 있는 부상당한 부위에 이식하기가.......

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공개 사항

유펑 첸 박사는 나노드 테라피의 공동 창립자입니다.

감사의 글

이 작품은 NIH (보조금 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF 경력 상 (1653702) 및 코네티컷 대학에 의해 재정적으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-디클로로에탄Alfa Aesar39121
2-시아노아세트산시그마-알드리치C88505
4-디메틸아미노피리딘TCI AmericaD1450
8웰 챔버 커버글라스Thermo Fisher 155409
96웰 플레이트Corning353072
앱솔루트 에탄올Thermo FisherBP2818500
아세톤시그마-알드리치179124
아세토니트릴시그마-알드리치34851
알릴아민시그마-알드리치145831
기본 플라즈마 클리너해릭 플라즈마PDC32G
구연산시그마-알드리치251275
농축 염산시그마-알드리치H1758
탈이온수써모 피셔15230147
디클로로메탄시그마-알드리치270997
디에틸 에테르시그마-알드리치296082
디-tert-부틸 디카보네이시그마-알드리치361941
에틸 아세테이트 시그마-알드리치319902
에틸카르바메이트Sigma-AldrichU2500
FibronectinThermo FisherPHE0023
고정액(PBS에서 제조된 4% 포름알데히드)Thermo FisherR37814
구아니디늄 염산염Alfa AesarA13543
헥산Sigma-Aldrich227064
Human 중간엽 줄기 세포LonzaPT-2501
메탄올시그마-알드리치34860
메틸 요오드화물시그마-알드리치289566
N,N-디이소프로필에틸아민알파 아이사르A17114
N,N-디메틸포름아미드시그마-알드리치227056
N-메틸모르폴린 N-옥사이드알파 아이사르A19802
오스뮴 테트라옥사이드Alfa Aesar45385
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher15140163
인산염 완충 용액Thermo Fisher20012050
염화인산 인Sigma-Aldrich201170
탄산칼Sigma-Aldrich347825
역상 컬럼Thermo Fisher25305-154630
Rhodamine PhalloidinThermo FisherR415
실리카겔TCI AmericaS0821
중탄산나트륨Sigma-AldrichS6014
에톡산화나트륨Alfa AesarL13083
소듐 주기드Sigma-Aldrich71859
황산나트륨Sigma-Aldrich239313
아황산나트륨Sigma-AldrichS0505
나트륨 트리아세테톡시보로하이드라이드Alfa AesarB22060
분광 광도계(NanoDrop One/Onec UV-Vis)Thermo FisherND-ONE-W
줄기세포 성장 매체 BulletKitLonzaPT-3001
테트라하이드로푸란, 시그마-알드리치, 401757
티오아니솔시그마-알드리치T28002
톨루엔, 시그마-알드리치179418
트리에틸아민알파 에Aesar, A12646
트리플루오로아세트산알파 아이사르, A12198
트리톤 X-100써모 피셔HFH10
트립신-EDTA 솔루션Thermo Fisher25200056
트 산 륨 , , , , , 자르 , , , ,

참고문헌

  1. Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
  2. Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E.

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