단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

요약

본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.

초록

타고난 면역 계통은 방류염, 당뇨병 망막병증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 안구 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 선천성 면역 세포, 특히 단핵 phagocytes는, 이 인구를 확인하는 도전을 만드는 중첩된 세포 표면 마커를 표현합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정은 마우스 눈에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포를 분화하기 위해 다중 세포 표면 마커의 동시적 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 전체 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화 및 골수성 세포 마커에 대한 단일 세포 현탁액의 염색을 설명합니다. 또한 단일 색상 컨트롤을 사용하여 전압을 결정하고 형광을 사용하여 양성 게이트를 구분하는 데 적합한 방법을 설명합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 한계는 조직 아키텍처의 부재이다. 이러한 제한은 개별 안구 구획의 다중 파라미터 흐름 세포측정또는 무료 면역형광 염색에 의해 극복될 수 있다. 그러나 면역 형광은 대부분의 현미경에 정량적 분석의 부족과 형광수 감소에 의해 제한됩니다. 우리는 레이저 유도 된 천체 신생 혈관화에서 단핵 phagocytes의 고도로 정량적 분석을 제공하기 위해 다중 파라메트릭 흐름 세포측정제의 사용을 설명합니다. 또한, 다중 파라미터 흐름 세포측정은 전사 또는 프로테오믹 연구를 위한 대식세포 서브세트, 운명 매핑 및 세포 분류의 식별에 사용될 수 있다.

서론

타고난 면역 계통은 보충 활성화 및 염증을 자극하는 다중 세포 모형을 포함합니다. 타고난 면역 세포는 자연 살인자 (NK) 세포, 비만 세포, basophils, 호산구, 호중구 및 단핵 phagocytes를 포함합니다. 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포로 구성된 단핵 phagocytes는, 포도막염, 당뇨병 망막증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 다중 안과 조건의 병리생리학에 연루되었습니다 (AMD)^1. 이 프로토콜에서는, 우리는 neovascular AMD^2의마우스 모형에 있는 다중 파라미터 유량 세포측정 분석을 사용하여 단핵 phagocytes의 식별에 집중할 것입니다. 이 프로토콜은 당뇨병 망막증 및/또는 방류염의 마우스 모델에 적응할 수 있지만 이러한 질병의 전신 특성 때문에 더 광범위한 안구 해부를 권장합니다.

단일 핵 세포는 중첩 세포 표면 마커를 표현합니다. 오래 지속되는 조직 상주 대식세포 및 마이크로글리아는 노른자 낭 유래 에리스로마일로이드 전구체^3로부터유래하며, 대식세포및 수지상세포를 재활용하면서 골수 유래 대식세포 수지상 세포 전구^4와분화한다. ....

프로토콜

모든 절차는 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. C57BL/6 마우스는 노스웨스턴 대학(시카고, 일리노이)의 비교 의학 센터의 장벽 시설에 수용되었습니다. 모든 동물은 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12/12 h 빛 / 어두운 주기에 보관되었다.

1. 안구 조직 의 수집

1. 마우스가 반응하지 않고 더 이상 흡입할 때까지 이산화탄소의 규제 투여를 사용하여 성관계를 10-12주 된 C57BL/6J 마우스를 희생하십시오. 자궁 경부 탈구 또는 안락사를 보장하기 위해 다른 승인 된 보조 방법을 수행합니다.
   참고: 경외 관류는 안구 조직에 없는 순환 백혈구를 제거하기 위해 수행될 수 있다. 이 실험에서 전신 관류는 치료되지 않거나 레이저로 처리된 전체 눈에서 검출된 마이크로글리아, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 수를 감소시키지 않습니다. 따라서, 이러한 세포 유형의 대부분은 안과 조직에 위치하고 이 단계는 선택 사항입니다.
2. 눈을 방출하려면 소켓에서 눈에 띄는 곡선 집게 한 켤레를 눈 아래에 부드럽게 놓으면서 눈 소켓 근처에서 아래로 밀어 넣습니다. 실제 눈을 압박하지 않고 눈 밑에 닫혀 있는 집게를 꼬집습니다. 주변 결막에서 눈을 떼어 (사전 간행물을 참조하십시오)

결과

도 1은 적색 레이저용 SCC 및 세포에 대한 보상되지 않은 주파수 히스토그램을 보였다: Alexa647, Alexa700, 및 APC-Cy7. 도 1A에서,마젠타 라인은 Alexa647에 대한 SCC의 피크를 묘사하고, 시안 선은 의도된 0.5 로그 차이를 나타냈다. Alexa700 및 APC-Cy7의 피크는 시안 선의 왼쪽(덜 밝은)에 있었다는 점에 유의하십시오. 또한 세포는 모두 마젠타 선의 왼쪽에 있었다는 점에 유의하십시오. SCC 피크의 오른쪽에 있는 모든 세포는 보상되지 않았습니다. 특정 채널은 플루오로크롬 염료의 화학에 기초하여 다른 채널로 유출하는 것으로 알려졌다(즉,. 바이올렛 레이저: BV421 -> V500, 옐로우 그린 레이저: PE-> PE-CF594, 레드 레이저: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, 크로스 레이저: PE-Cy7 ->.......

토론

다중 파라미터 유동 세포측정은 복잡한 조직에서 다중 세포 유형의 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 보고서에서는 마우스 눈의 레이저 부상 후 단핵 세포, 수지상 세포 및 대식세포 서브셋을 포함한 단일 핵 세포 개체 개체 집단의 유동 세포 측정 검출을 설명합니다. Liyanage 등은 최근 호중구, 호산구, 림프구, DC, 대식세포, 침투 대식세포 및^{단핵구(27)를}검출하기 위한 유사한 게이팅 전략을 보고했다. 우리의 게이팅 전략은 주로 CD64의 추가에 의해 다릅니다. Liyanage 등은 DC를 CD4 -^CD8-B220^-CD11b⁺CD11c⁺ 세포, 및 대식세포CD4^-CD8^-B220^-CD11b⁺CD11c^-NK1.1^-Ly6G^- 셀로 식별합니다. 우리는

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-120
1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브	Costar	3620
10ml 피펫	Fisher Scientific	431031
15ml 원추형	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500ml	Gibco	14025-092
2.5ml 주사기	Henke Sass Wolf	7886-1
20% 파라포름알데히드 용액	전자 현미경 과학	15713-S
25ml 피펫	Fisher Scientific	431032
30G 바늘	Exel	26437
3ml 루어 잠금 주사기	Fisher Scientific	14955457
41 x 41 x 8mm 폴리스티렌 무게 접시	Fisher Scientific	08-732-112
50ml 원뿔	Falcon	352070
96-well, 뚜껑이 없는 U-하단 분석 플레이트	Falcon	353910
아민 반응성 비드	ThermoFisher	A10628
분석 소프트웨어	FlowJo	v 10
안티 랫 및 안티 햄스터 Ig 카파 비드 세트	BD Biosciences	552845
C57BL/6J 마우스	Jackson Laboratory	664
세포 계수기	Invitrogen	AMQAX1000
세포 계수기 슬라이드	Invitrogen	C10283
보상 비드	ThermoFisher	01-1111-42
카운트 비드	ThermoFisher	01-1234-42
곡선 겸자	Fisher Scientific	16-100-123
소화 효소	Sigma Aldrich	5401020001
해부 현미경	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
해리 튜브	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
전자 해리기	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva 소프트웨어	BD Biosciences
Fc 블록, 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32	BD Biosciences	553142
미세 집게	Integra Miltex	17035X
플로우 버퍼	Miltenyi Biotec	130-091-221
유세포 분석기	BD Biosciences
플로우 튜브	Falcon	352008
Hamster 안티 마우스 CD11c BV421	BD Biosciences	562782
Ice	bucket Fisher Scientific	07-210-123
Live/Dead dye	ThermoFisher	65-0866-14
용해 용액, 10x 용액	BD Biosciences	555899
Micro titer tube and rack	Fisher Scientific	02-681-380
마우스 안티 마우스 CD64 PE	BioLegend	139304
마우스 안티 NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
P1000 피펫 팁	Denville Scientific	P2404
P1000 피펫	Gilson	FA10006M
P2 피펫 팁	eppendorf	22491806
P2 피펫	Gilson	FA10001M
P20 피펫 Gilson		FA10003M
P200 피펫 팁	Denville Scientific	P2401
P200 피펫터	Gilson	FA10005M
Pipet man	Fisher Scientific	FB14955202
쥐 안티 마우스 B220 PECF594	BD Biosciences	562313
쥐 안티 마우스 CD11b APC-Cy7	BD Biosciences	557657
쥐 안티 마우스 CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
쥐 안티 마우스 CD19 PE	BD Biosciences	553786
쥐 안티 마우스 CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
쥐 안티 마우스 CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
쥐 안티 마우스 CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
쥐 안티 마우스 CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
쥐 안티 마우스 Ly6C	BD Biosciences
쥐 안티 마우스 Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
쥐 안티 마우스 MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
쥐 안티 마우스 Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
쥐 안티 마우스 Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
쉐이킹 인큐베이터	Labnet	311DS
스프링 가위	Fine Science Tools	15024-10
멸균 세포 여과기, 40mm 나일론 메쉬,	Fisher Scientific	22363547
멸균수, 500ml,	Gibco	A12873-01
스윙 버킷, 원심분리기	eppendorf	5910 R
, Trypan blue, 0.4% 용액	Gibco	15250061

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