신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
게놈 전체 협회 연구가 많은 신경 질환의 이기종 유전 기초에 빛을 발산으로, 뇌 개발 및 기능에 특정 유전자의 기여를 연구 할 필요가 증가. 생생 마우스 라인이 매우 비용이 많이 들고 많은 새로운 질병 관련 유전자가 아직 상업적으로 이용 가능한 유전 라인을 가지고 있지 않기 때문에 특정 유전 조작의 역할을 연구하기 위하여 마우스 모형에 의지하는 것은 항상 가능하지 않습니다. 또한 마우스 선을 만드는 데 수년간의 개발 및 유효성 검사가 걸릴 수 있습니다. 자궁에서 전기 기공은 특정 유전 적 조작을 달성하기 위해 DNA 플라스미드를 개발해야만 하는 생체 내에서 세포 형 특정 방식으로 유전자 발현을 조작하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공한다. 자궁 전기화의 양자는 전두엽 피질 피라미드 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 유전자 전달 방법과 행동 접근법을 결합하면 전두엽 피질 네트워크의 기능과 청소년 및 성인 마우스의 사회적 행동에 대한 유전 조작의 효과를 연구 할 수 있습니다.
서론
게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 뇌 병리1,2,3,4와관련된 새로운 후보 유전자의발견을주도했다. 이러한 연구는 정신 분열증 (SCZ)과 같은 치명적인 신경 정신 장애를 이해하는 데 특히 도움이되었으며, 새로운 유전자의 조사는 새로운 연구 및 치료 개입 라인의 시작 점으로 사용되었습니다5,6. SCZ에 대한 위험을 품고 있는 유전자는 산전 및 조기 산후 발달 중 전두엽 피질(PFC)에서 편향된 발현을 나타내며, 이는 여러 신경정신장애의 병리학에 연루된영역(7)이다. 또한, 정신 장애의 마우스 모델은 PFC 네트워크6,8,9에서비정상적인활성을나타낸다. 이 결과는 SZC 관련 유전자가 이 지역의 발달 배선에 있는 역할을 할 지도 모른다는 것을 건의합니다. 동....
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프로토콜
모든 실험 프로토콜은 동물 연구를위한 국립 보건원 (NIH) 지침에 따라 수행되었으며 보스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. DNA 용액 준비
- 바람직한 프로모터와 플라스미드로 관심 있는 유전자를 상업적 플라스미드 또는 서브클론을 구입하십시오. 여기서, CAG 프로모터(pCAG-EGFP)의 밑에 EGFP를 함유하는 플라스미드가 사용되었다.
참고: 필요한 식 수준에 따라 원하는 프로모터를 결정합니다. 일반적으로 CAG 프로모터 의 밑에 플라스미드는 세포 모형 특정 프로모터 (예를 들면, 뉴런을 위한 시냅신)가 보다 적게 활성화되는 경향이 있는 반면, 트랜스진의 상부를 달성하기 위하여 이용될 수 있습니다. 실험자는 각 플라스미드에 대해 적절한 식 수준을 경험적으로 결정해야 합니다. - 박테리아를 변형 하 고 적절 한 항생제와 세균 성 매체에서 주식을 성장.
- -80°C에서 유능한 세포(DH5α 셀)를 제거하고 20분 동안 얼음 위에서 해동하십시오.
- 플라스미드 DNA의 100 pg-100 ng를 유능한 세포의 30 μL과 혼합합니다. 20 분 동안 얼음에 혼합물을 배양.
- 42°C 수조에서 45s의 수조를 배양한 다음....
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결과
맞춤형 전기포레이터와 3개의 갈래 전극의 성공적인 개발 및 구현.
IUEs의 경우, 이전에 설명된설계(27)를 기반으로 저렴한 맞춤형 내장 전기포레이터를 제작하였다(도1A 및 도 2). 3개의 갈래 전극이23,24개의 플라스틱 집게를 사용하여 갈래의 끝에 부착된 2개의 음극을 사용했고, 양극은 칫솔 손잡이(도1B)의끝에 부착되었다. 전기포레이터와 3개의 갈래 전극은 적절한 기능을 보장하기 위해 테스트되었습니다. IUE는 자궁 뿔을 노출하고 플라스미드 DNA를 주입하고 각 배아(도1C)를전기화하여 수행하였다. 3개의 갈래 전극은 배아의 머.......
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토론
본명, 파이프라인은 전두엽 피질 뉴런의 큰 집단에 대한 관심의 새로운 유전자의 조작을 마우스의 행동 분석과 결합하는 것으로 기술된다. 더욱이, 이 파이프라인은 초기 산후 발달 과 성인기에 둘 다 동일 마우스에 있는 행동의 종방향 연구 결과를 허용합니다. 이 기술은 시간과 비용의 관점에서 비용이 많이 들 수 있는 유전 동물 모델에 의지할 필요성을 우회합니다. 이 프로토콜의 강도는 최근 GWAS가 새로운 유전 협회28,29를발견한 신경 발달 및 신경 정신 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 흥분성 뉴런의 세포 형 특정 전환을 제공하지만, 한 가지 제한은 인터뉴런 또는 신경교 세포와 같은 다른 뇌 세포 유형을 대상으로 하는 것이 덜 가능하다는 것입니다. 그러나, 여러 연구는 다른 뇌 세포 유형을 대상으로 수정 된 접근 방식을 제안30,
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 중요한 피드백과 원고에 편집 리사 크레츠지 감사합니다. 우리는 행동 두뇌의 관류 및 세포 계산을 돕는 데 귀중한 크루즈 - 마르틴 실험실의 모든 연구 조수에게 감사드립니다. 우리는 삼극성 전극의 디자인에 대한 입력 안드레제이 Cwetsch 감사, 그리고 토드 블루테와 보스턴 대학 생물학 이미징 코어는 공초점 현미경의 사용에 대한. 이 작품은 NARSAD 젊은 조사자 그랜트 (AC-M, #27202), 브렌튼 R. 루츠 상 (ALC), I. 알덴 맥치 상 (ALC), NSF NRT UtB : 신경 광장 국가 연구 펠로우십 (ALC, #DGE1633516), 보스턴 대학 학부 연구 기회 프로그램 (WWY)에 의해 지원되었다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 13mm 실크 블랙 브레이드 봉합 | Havel's | SB77D | 봉합사 스킨 |
| 애드슨 집게 | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 웹캠 | Logitech | N/A | 기록 동작 |
| Electroporator | 맞춤형 | N/A | 그림 1 및 2 참조 및 Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 스핀 컬럼 플라스미드 DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid 준비 |
| 빠른 녹색 FCF | 시그마 | F7252-5G | 염료 DNA 용액 |
| 미세 가위 - 날카로운 | FST | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand 거즈 스폰지 | 피셔 사이언티픽 | 1376152 | IUE |
| Gaymar 난방 / 냉각 | Braintree | TP-700 | 가열 패드 |
| 유리 피펫 풀러 | 셔터 기기, | P-97 | IUE |
| 유리 피펫 | 셔터 기기, | BF150-117-10 | IUE |
| 제모 로션 | Nair | N / A | 제모 |
| Hartman 지혈 | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| 오픈 필드 미로 - 수제 아크릴 경기장 | 맞춤형 | 내장 N / A | 50 × 50 × 50 × 30 cm 길이 - 너비 - 높이 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | III의 발현을위한 포유류 발현 벡터 |
| Parker Hannifin | N / A | 압력 인젝터 | |
| 견인기 - 2 갈래 무딘 | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| 링 집게 | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| 살균기, 드라이 비드 | 시그마 | Z378569 | sterelize 수술 도구 |
| 봉합사, 3/0 PGA, FS-2, 수의사 전용 바이올렛 | Havel's | HJ398 | 봉합사 근육 |
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참고문헌
- Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).
- Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium.
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