많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.
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이 논문에서
요약
초록
운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. "국경 횡단"분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
서론
박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서
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프로토콜
1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리
참고: 이 방법을 광범위한 '캐치-올'로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다.
- 소프트 마고 플레이트 준비
참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)입니다.- 바토-한천 3g(0.3% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O(이중 증류수) L 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.
- 121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.
- 위와 같이 막대/접시를 사용하여 부드러운 교반으로 식힙니다. 온도가 약 50°C에 도달하면 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 25mL을 붓고, 16시간 이내에 사용하기 위해 용융 된 한천을 뚜껑으로 1 시간 이상 제자리에 놓아 두도록 하십시오.
- 억제제 돌연변이의 문화 준비,....
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결과
그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어집니다. YcgR은 c-di-GMP 이펙터입니다. c-di-GMP가 있는 복합체에서 YcgR은 플래그젤라 로터에 결합하여 먼저 CCW 모터 회전을 유도하고 모터 속도를 감소시킵니다. 세포 테더링 및 구단 애약은 모터 행동이 이중 돌연변이체에서 정상으로 돌아왔지만 부드러운 한천의 운동성은34가아니라는 것을 보여주었습니다. 따라서 이중 돌연변이체(도 1C)에서 의사 재생성 플레어를 격리하기 위해 프.......
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토론
억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 보장하기 위해 여러 독립적 인 복제를 포함하는 것이 중요합니다. 스팟이 아닌 선로로 배양을 줄임으로써 박테리아의 수를 늘리면,억제제(41)를생성할 확률을 향상시킬 수 있다. 동일한 돌연변이의 격리 (DNA 염기서열에 의해 결정된 대로) 여러 번 그 진위여부에 대한 자신감을 증가시킵니다. WGS는 항상 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken 한천 | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | ||
| LB (Lennox) 육수 | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| 폴리-L-라이신 용액 (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| 인산칼륨 이염기성 (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials and Equipment | |||
| CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | 또는 이와 동등한 현미경 사용 소프트웨어 | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
| 젖빛 현미경 슬라이드 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 현미경 | Olympus | BX53 | 모든 직립 또는 반전 위상 현미경을 사용할 수 있습니다 |
| 페트리 접시 (직경 100mm)Fisher | Scientific | FB0875712 | 소프트 한천 분석 |
| 용 폴리에틸렌 분무기 모세관 튜브 (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | ||
| 라운드 페트리 접시 2 | VWR | 89200-944 | 국경 통과 분석용 |
| 안전 피하 주사 바늘 (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| 멸균 주사기 - 1 mL | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 작업/조직 물티 | Fisher Scientific | 06-666 | 또는 이에 상응하는 일회용 티슈 물티슈 |
| VWR 마이크로 커버 - 유리 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 카메라 | 올림푸스 | XM10 | 또는 동급 현미경 카메라 |
참고문헌
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57
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