방법 논문

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

DOI:

10.3791/61365

⸱

2020년 6월 10일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 클라미디아 트라코마티스의발달 돌연변이를 식별하고 격리하기 위해 방향유전 적 접근법에서 형광 프로모터 기자, 살아있는 세포 현미경 검사법 및 개별 포괄 추출을 활용합니다.

초록

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세포 내 세균성 병원체 클라미디아 트라코마티스는 두 가지 형태학적으로 이산적 발달 형태로 구성된 발달 주기를 겪는다. 비 복제 초등체 (EB)는 호스트의 감염을 시작합니다. 일단 내부에, EB는 망상 몸으로 분화 (RB). 그런 다음 RB는 전염성 EB 양식으로 다시 분화하기 전에 여러 차례의 복제를 수행합니다. 이 주기는 세포 모형 사이를 전환하는 실패가 호스트 침입 또는 복제를 방지하기 때문에 클라미홈 생존을 위해 필수적입니다.

클라미디아의 의무적인 세포 내 특성으로 인한 유전 적 기술의 한계는 세포 형 발달에 관여하는 분자 메커니즘의 식별을 방해했습니다. 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법과 함께, 실시간으로 세포 형 전환의 시각화를 허용하는 새로운 이중 프로모터 기자 플라스미드 시스템을 설계했습니다. 세포형 발달의 조절에 관여하는 유전자를 확인하기 위해, 살아있는 세포 프로모터-리포터 시스템은 이중 리포터 균주의 화학돌연변이발생, 클라미디아의 화상 진찰 및 추적을 변경된 발달 운동과 결합하여 돌연변이체의 클로나 탈린을 결합하여 전진 유전적 접근법의 발달을 위해 활용되었다. 이 전진 유전 워크플로우는 광범위한 유전 적 경로로 지시 된 심문을 위해 수정 할 수있는 유연한 도구입니다.

서론

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클라미디아 트라코마티스(Ctr)는 생존과 증식1에필수적인 이중협발달주기를 통해 진행되는 의무적인 세포내 병원체이다. 이 주기는 두 가지 발달 형태, 초등체 (EB) 및 망상 체체 (RB)로 구성됩니다. EB는 복제 무능하지만 이펙터 유도 내분비증2를통해 세포 침입을 중재한다. 호스트에 도착하면 EB는 복제 RB로 성숙합니다. RB는 후속 감염 라운드를 시작하기 위해 EB로 다시 변환하기 전에 여러 복제를 수행합니다.

유전 공구의 제한된 배열은 생화학 연구 또는 대리 시스템의 사용에 클라미다이얼 연구의 대부분을 제한했습니다. 그 결과, 유전자 조절및 발달주기의 제어의 해명성은3,,4. 클라미얼 필드에서 더 중요한 도전 의 한은 클라미온 발달 주기의 고해상도 측량 추적 및 그것의 규칙에 관련된 단백질의 식별입니다. 클라미온 발달 주기 동안 유전자 발현은 전통적으로 RNAeq, qPCR 및 고정 세포 현미경 검사법을 포함하는 파괴적인 "종점" 방법에 의해 수행되어 왔다5,,6. 이러한 방법은 귀중한 정보를 제공했지만, 사용되는 기술은 힘들고 낮은 시간적 해상도5,,6을가지고 있다.

지난 10년 동안 Ctr의 유전자 조작은 플라스미드 변환 및 돌연변이 발생에 대한 방법의 도입으로 진행되었습니다77,8,,9. 이 연구를 위해, 플라스미드 기반 시스템은 감염의 과정을 통해 실시간으로 개별 포함에 있는 클라미다이얼 발달을 감시하기 위하여 개발되었습니다. RB 및 EB 세포 형 특정 프로모터 리포터를 모두 표현한 클라미타임 트랜스포메이션이 만들어졌습니다. RB 특이기자는 형광 단백질 클로버의 초기 RB 유전자 유오 상류의 프로모터를 융합시킴으로써 구성되었다. EUO는 후기 EB 관련 유전자10의하위 집합을 억압하는 전사 레귤레이터입니다. EB 핵응축에 관여하는 히스톤과 같은 단백질을 인코딩하는 hctB의발기인은 EB특이기자(11)를만들기 위해 mKate2(RFP)의 상류로 직접 복제되었다. hctB무도m-mKate2/euoeuo무도회-클로버의 백본은 p2TK2SW27이었다. hctB및 euo 프로모터는 Ctr-L2 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 각 프로모터 서열은 지정된 클라미다이얼 유전자에 대한 예측된 전사 시작 부위의 상류 ~100개의 염기 쌍과 각각의 ORF의 첫 30뉴클레오티드(10개의 아미노산)로 구성되었다. 형광 FP 변이체는 Ctr codon최적화 유전자 블록으로 상업적으로 얻어지고 각 클라미원 유전자 및 프로모터의 처음 30뉴클레오티드와 함께 프레임에서 복제되었다. incD 종기는 mKate2의 바로 하류로 복제되었습니다. 두 번째 프로모터 리포터는 incD 종기의 하류에 삽입되었습니다. p2TK2SW2의 암피실린 내성유전자(bla)는pBam4로부터 aadA 유전자(Spectinomycin 저항)로 대체되었다. 이로 인해 Ctr-L27로변형된 최종 구조 p2TK2-hctB 무도회-mKate2/euo 무도회-클로버(그림1A)가그 결과.hctBeuo 이러한 RB/EB 리포터 균주는 살아있는 세포 현미경검사(도1B, C)를사용하여 단일 내의 발달 주기의 관찰을 허용했다.

화학 돌연변이 발생과 함께 우리의 발기인 기자 구조를 채택, 프로토콜추적하고 Ctr 세로바르 L2의 돌연변이 인구에서 개발 이상을 나타내는 개별 클론을 분리하기 위해 고안되었다. 이 프로토콜은 개별 클라미다이얼 포함의 직접적인 감시를 허용하고, 시간이 지남에 따라 유전자 발현 프로파일의 추적, 변경된 발달 유전자 발현 패턴을 표현하는 클라미얼 클론을 식별하고, 개별 적인 포함에서 클라미디아의 클로나 절연을 확인합니다.

이 프로토콜은 클라미원 발달에 관여하는 유전자의 확인을 위해 특별히 만들어졌지만, 클라미온 유전 경로의 수를 심문하기 위해 쉽게 적응될 수 있었습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에 사용되는 모든 파이썬 스크립트는 Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing 사용할 수 있습니다.

1. 기자 클라미디아 를 돌연변이

참고: Ctr-L2-hctB prom-mKate2/euo 무도회-클로버 EBs는 이 매체가 EB 감염성12의EB 대사 및 유지관리를 지원함에 따라 축성 매체 CIP-1에서 에틸 메탄술포네이트(EMS)를 사용하여 직접 돌연변이하였다.hctBeuo

  1. p2TK2-hctB 무도m-mKate2/euo 무도회-클로버 리포터 플라스미드및 펠릿으로 변형된euo~3 x 107 EB가 포함된hctB 얼음에 클라미얼 스톡을 4°C에서 30분 동안 해동한다.
    참고: 이러한 실험에 사용되는 클라미디아 유기체는 30% 리노그라핀 밀도가 -80°C에서 1배 자당-인산염-글루타민트 버퍼(SPG)로 정제및 냉동되었다.
  2. 10초 동안 10%의 전력으로 얼음에 초음파 처리하여 CIP-1 버퍼의 100 μL에서 슈퍼플렛을 폐기하고 EB 펠릿을 재연합니다. EB 서스펜션 100 μL을 돌연변이 및 모의 처리 된 샘플을 위해 두 개의 50 μL 알리쿼트로 나눕니다.
  3. 별도의 1.5 mL 마이크로 센드심분리기 튜브에 EMS-CIP-1 용액 20 mg/mL을 준비합니다. 이렇게 하려면 총 375μL에 EMS 6.8 μL을 추가합니다.
  4. EMS-CIP-1 용액의 50 μL을 돌연변이 발생을 위한 클라미톨 알리쿼트 중 하나에 넣고, CIP-1의 50 μL은 모의 돌연변이 발생을 위한 다른 클라미톨 알리쿼트에만 추가합니다.
    참고: 최종 EMS 농도는 10 mg/mL입니다. 클라미다이얼 티터, EMS 농도 및 이 프로토콜에 사용되는 노출 시간은 전염성 자손의 약 60-80% 감소로 이어집니다. 이러한 감소 수준은 클라미다이얼 게놈당~5-20 DNA 병변에 해당8.
  5. 실온에서 20분 동안 배양하십시오. 돌연변이 된 EB는 섹션 2에서 단층층을 감염시키기 위해 직접 사용됩니다.
    주의: EMS는 알려진 발암 물질입니다. EMS와 접촉하는 모든 장비 와 재료는 폐기 하기 전에 24 시간 동안 1 M NaOH에 담가야 하며, 장갑은 EMS 재료의 프로토콜 및 정화 중에 항상 사용되어야 합니다.

2. 돌연변이 Ctr의 이미징

  1. 돌연변이 Ctr의 화상 진찰 및 격리를 위한 호스트 세포 배양
    1. 6 x 105 코스-7 셀(ATCC)이 2mL의 완전한 미디어(RPMI-1640은 10% 태아 소 혈청과 10 mg/mL 젠타미신으로 보충)로 잘 어울린 6개의 유리 바닥 판을 시드합니다. 돌연변이 Ctr의 이미징에 이 유리 바닥 플레이트를 사용하십시오.
    2. 1 mL 완성 매체에서 잘 당 1 x 105 코스-7 셀 (ATCC)을 가진 24 개의 잘 폴리스티렌 플레이트를 시드하십시오. 관심의 고립 된 클라미디아의 재감염이 폴리스티렌 플레이트를 사용합니다.
    3. 플레이트를 5% CO2,37°C에서 약 18시간 동안 배양한다. 세포가 합류에 도달하면 미디어를 1 μg/mL의 사이클로헤시미드로 보충한 완전한 매체로 교체하고 하룻밤 동안 배양하십시오.
  2. 돌연변이 Ctr로 숙주 세포 배양 감염
    1. 1.5mL/잘 얼음 차가운 HBSS에 돌연변이 된 EB의 ~6 x 105와 유리 바닥 플레이트의 5 우물을 감염. 이것은 돌연변이 발생으로 인해 ~ 70 %의 사망률이 예상됨에 따라 ~ 0.3의 MOI를 초래할 것이다.
    2. 1.5 mL / 잘 얼음 차가운 HBSS에서 ~ 2 x 105 모의 돌연변이 된 EB로 나머지 를 잘 감염. 돌연변이 발생 없이, 더 적은 사망률을 기대, 따라서 접종의 1/3 ~의 MOI를 달성 하기 위해 사용 됩니다.0.3.
      참고: ~0.3의 MOI는 호스트 세포가 단일 EB에 의해 감염되고 클로날 절연을 위한 감염된 세포 간의 충분한 분리를 허용합니다.
    3. 37 °C에서 15 분 동안 접시를 흔들어 배양하십시오.
    4. 감염된 숙주 세포를 예열(37°C)으로 세척하여 1 mg/mL 헤파린을 함유한 HBSS를 세척한 후 HBSS 헹구는 즉시 된다. 헤파린 세척을 반복하여 HBSS로 즉시 2배 헹구어 헤파린을 제거합니다.
      참고: 헤파린은 숙주 세포와EBs(13)사이의 초기 정전기 상호 작용을 억제하고 되돌릴 수 있다. 헤파린 세체는 아직 숙주 세포를 입력하지 않은 EB를 제거하여 감염을 동기화합니다. 셀을 세척할 때 우물 표면에서 세포를 소독하는 것을 방지하기 위해 부드럽게 합니다. HBSS 및 헤파린 솔루션은 잔류 EMS를 포함하고 폐기하기 전에 24 시간 동안 1 M NaOH를 포함하는 비커에 배치해야합니다.
    5. HBSS를 예동(37°C) 이미징 미디어(전체 매체, 1 μg/mL 사이클로헤시미드, 20mM HEPES 및 페놀 레드 없음)로 4mL/웰로 대체하십시오.
    6. 인터웰 공간을 예동(37°C)으로 채우고H2O를 분해하여 온도 조절을 돕고 증발을 줄입니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 10시간 동안 5% CO2로 배양합니다.
  3. 현미경 설정 및 이미징
    참고: 다색 다중 처리 자동화된 살아있는 세포 형광 화상 진찰은 발달 유전자 발현 역학에서 다른 클라미멈 돌연변이를 확인하기 위하여 시간 경과 심상을 수집하는 데 이용됩니다. 이 프로토콜은 자동화된 현미경 제어를 위해 오픈 소스 μManager 소프트웨어 패키지를 활용합니다.14.
    1. 현미경 설정 10 시간 사후 감염을 시작합니다. 현미경 단계 인큐베이터를 5% CO2,37°C로 설정합니다. 감염된 6 개의 잘 유리 바닥 플레이트를 단계 인큐베이터에 넣고 샘플 테러미터를 인터웰 H2O에 삽입합니다.
    2. 고콘텐츠스크리닝(HCS)플러그인을 사용하여 XY 스테이지를 보정합니다. 플러그인을 클릭 | 획득 도구 | μManager 현미경 제어소프트웨어(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2)에서HCS 사이트 발생기.
    3. 6웰 플레이트 템플릿을 선택하고 HCS 플러그인(JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4)내에서12개의 시야(FOV)로 구성된 이미징 위치 목록을 생성합니다. 스테이지 위치 목록을 열고 스테이지 컨트롤 플러그인(JoVE61365_screenfile5,JoVE61365_screenfile6)을사용하여 각 FOV에 대한 초기 Z 위치를 수동으로 집중하고 설정합니다. 셀이 없거나 균일한 단층레이어를 포함하지 않는 FOV의 XY 좌표를 조정합니다.
      참고: 각 이미지를 캡처하는 데 걸리는 시간으로 인해 30분 간격으로 최대 72FOV를 사용할 수 있습니다.
    4. 이미징을 위해 20배 의 객관적인 렌즈를 사용하십시오. 이 배율덕분에 원하는 해상도를 제공하면서 FOV당 ~8개의 포함을 이미지화할 수 있습니다.
    5. 데이터분석(JoVE61365_screenfile7)이후에관심 포함을 찾는 데 사용되기 때문에 위치 목록을 저장합니다.
    6. 이미징 소프트웨어에서 자동 초점 옵션을 사용하여 자동이미징(JoVE61365_screenfile8)에초점을 설정합니다.
    7. 다음 선택 사항과 값을 사용하여 μManager에서 이미지 기반 자동 초점을 사용하여 가장 일관된 포커스 결과를 생성합니다. 자동 초점 속성 창에서 드롭다운 메뉴에서 OughtaFocus를 선택하고 다음 설정을 사용합니다. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocus-노출: 0.3, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, 원타포커스-쇼이미지: 예, 요타 포커스-쇼이미지: 예, 요타 포커스-쇼이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-최대화: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지: 예, 요타 포커스-쇼 이미지
      참고: 자르기 계수를 줄여 자동 초점 이미징 창을 줄이면 보다 일관된 자동 초점 집중이 가능합니다. OughtaFocus-ShowImages에 대한 예를 선택하면 사용자가 자동 초점 이미지를 볼 수 있습니다.
    8. 30분간격(JoVE61365_screenfile9)으로24시간 동안 이미징하여 발달 주기의 운동을 포착한다. 12-36 HPI 사이의 이미징은 클라미디아가 발달 주기를 완료하지만 숙주 셀을 lyse하지 않도록합니다.
    9. GFP 및 RFP 채널에서 250ms 노출을각각(JoVE61365_screenfile10)으로이미지합니다. 514/30 nm 밴드패스 배출 필터로 470 nm에서 클로버(GFP) 신호를 감지합니다. 595 nm에서 641/75 nm 밴드패스 배출 필터를 통해 mKate2(RFP) 신호를 감지합니다.
      참고 : 흥분 강도를 최소화하는 것은 클라미디아에불소 광 표백 및 광 독성을 최소화하는 데 중요합니다. 200-300ms 노출로 해결된 이미지를 생성하는 최소 흥분 강도는 파일럿 연구에서 경험적으로 결정되어야 합니다.
    10. 포커스 슬라이스의 양쪽에서 끝나는 초점 범위의 여러 Z 슬라이스를 캡처합니다. 이 실험에서는 20배 배율로 10μm단계(JoVE61365_screenfile11)에서4개의 슬라이스로 달성하였다.
    11. 획득 창에서 여러 조각을 이미징할 때 상대 Z를 선택합니다. 상대 Z 옵션은 이미징 위치 목록에 저장된 Z 평면 위치를 다음 시간 간격의 시작점으로 사용합니다. 형광 이미징채널(JoVE61365_screenfile12)에적합한 Z 오프셋 값을 입력합니다.
      참고: 이미지 기반 초점 시스템은 불완전하며 24시간 이상의 이미징 기간동안 초점 드리프트로 이어집니다. 매 시간 마다 3-4 Z 초점 평면을 캡처하여 초점 이미지가 유지되는 것으로 나타났습니다. 형광 이미지 채널과 DIC 채널 사이의 초점 평면의 차이를 보정하려면 Z 오프셋이 필요합니다. 이 Z 오프셋의 경험적 결정이 필요합니다.
    12. 루트 디렉토리를 선택하고 실험이름을 지정하여 이미지를 저장합니다. μManager 이미지 스택 파일 옵션을 사용하여 이미지를 티프 스택 파일(JoVE61365_screenfile13)으로 저장합니다.JoVE61365_screenfile13
    13. 멀티 D 획득창(JoVE61365_screenfile13)에서 수집 댓글 상자에 실험 세부 정보를 기록합니다. 즉, 음 A1: 치료되지 않은 제어. 잘 A2-3 및 B1-3: EMS 돌연변이. 이미징: 12-36HPI. 12HPI에서 이미지 수집을 시작합니다.
      참고: μManager를 사용하는 경우 실험이 완료된 후 프로그램, 실험 설정 및 현미경 하드웨어를 실행상태로 둡니다. 화상 진찰 사이트는 돌연변이 된 인구의 분석이 완료되면 포함 격리를 위해 다시 검토될 것입니다.

3. 변형된 발달 표현형으로 돌연변이된 클라미디아를 식별하고 분리합니다.

  1. 포커스 내 이미지 스택 만들기
    1. 시간당 4Z 슬라이스가 포함된 저장된 이미지 데이터를 사용하여 Z 스택에서 가장 포커스가 있는 이미지를 추출합니다. 쿠르토시스 측정 옵션 사용(분석 | ImageJ/FIJI에서 포커스 Z 슬라이스(가장 높은 쿠르토시스 점수)를 자동으로 식별하고 이러한 초점 이미지만으로 새 이미지 스택을 만듭니다. 파이썬 스크립트는 이 프로세스를 자동화하기 위해 보충파일(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)으로포함됩니다.
  2. 개별 포함에 있는 형광 표현을 정량화합니다
    참고 : 두 기자의 발현 역학을 정량화하려면 오픈 소스 이미지 분석 응용 프로그램 ImageJ / FIJI및 플러그인 트랙메이트(15)를사용합니다. 트랙메이트는 '스팟'(이 경우 포함에 해당)을 식별하고 시간 경과 이미지 스택을 통해 시간 경과 이미지 스택을 통해 시간을 경과하여 각 포함에 대한 X, Y 위치 및 신호 강도를기록합니다(JoVE61365_screenfile14). 이 정보는 CSV 파일로 저장되며 분석을 위해 사용자 지정 Python 전자 필기장으로 가져옵니다.
    1. 플러그인을 클릭하여 바이오 포맷 수입업체를 사용하여 ImageJ/FIJI에서 포커스 Z 감소 이미지 스택을 엽니다 | 바이오 형식 | 바이오 포맷 수입자. 하이퍼스택 및 컴포지트(JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16)를선택합니다.
    2. 프로세스를 클릭하여 이미지 배경을 뺍니다 | 50.0 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용하여 배경을 빼고 포화 픽셀의 이미지 대비를 0.3%로 향상시킵니다(프로세스| 대비를 향상시킵니다). 이미지 값을 10.0으로 곱함(프로세스 | 수학 | ))(JoVE61365_screenfile17- JoVE61365_screenfile22)를곱합니다.
    3. 트랙메이트(플러그인 | 추적 | 트랙메이트)는48픽셀의 추정 Blob 직경을 선택합니다(이미징 끝에 포함된 크기에 따라 경험적으로 결정됨). 연결 최대 거리와 8.0 픽셀의 갭 클로징 최대 거리 및 갭 클로징 최대 프레임 간격 1(JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25)을선택하여 단편화되지 않은 포괄 트랙을 생성합니다.
      참고: 전체 사이클에 걸쳐 포함을 식별하고 추적하는 트랙메이트의 능력을 향상시키기 위해 이미지J/FIJI의 이미지 수학 기능을 사용하여 euo무도회 및 hctB무도회 채널을 함께 추가하여 별도의 이미지 채널이 만들어집니다. 그런 다음 이 채널은 Trackmate에서 시간이 지남에 따라 포함을 식별하고 팔로우하는 데 사용됩니다. 유오무도회 및 hctB무도회 채널의 형광 값은 채널 2 및 3에 기록됩니다.
    4. 최소 연속 지속 시간을 충족하는 트랙 기록: 트랙 기간: 20(JoVE61365_screenfile26). 트랙을 분석하고 트랙 통계에서 스팟을 CSV 파일(JoVE61365_screenfile27)으로 저장합니다.JoVE61365_screenfile27
      참고: 이 프로세스는 보충데이터(TrackMate_Zreduced_JOVE.py)에제공되는 사용자 지정 Python 스크립트를 사용하여 자동화되었습니다.
  3. 변경된 개발 프로파일로 포함 트랙 식별
    참고: 포함된 포함 을 식별하려면 Chlamydia 변경된 개발 프로파일을 사용하여 각 포함 트랙은 Python 노트북을 사용하여 시각화되었습니다. 이러한 시각화는 모의 치료 된 인구와 다른 운동 유전자 발현 프로파일을 가진 포함물의 식별을 허용합니다. 변경된 발달 프로그래밍을 사용하여 포함을 식별하는 데 사용되는 파이썬 노트북은 보충 데이터에 제공됩니다(EMS_Screen 마크다운).
    1. EMS_Screen 마크다운 파이썬 노트북의 가져오기 셀을 사용하여 통계 CSV 파일을 판다 데이터 프레임으로 트랙의 스팟에서 포함 트랙 데이터를 가져옵니다.
    2. 기준선은 기준 선도 셀을 사용하여 트랙값의 나머지 부분에서 각 트랙의 최소 값을 빼서 각 트랙을 수정합니다. 피클 셀로 저장을 사용하여 결과 값을 피클 파일로 저장합니다. 이렇게 하면 나중에 검색할 수 있는 기준 감도 후 채널 값이 영구적으로 저장됩니다.
      참고: 기준선 빼기는 모든 포함의 시작 형광 강도를 0으로 설정합니다.
    3. 형광 프로파일이 완전히 캡처되지 않을 수 있기 때문에 필터 모서리 셀을 사용하여 FOV 의 가장자리 근처에 있는 포함에서 흔적을 제거합니다. 이러한 추적은 거짓 양성 발달 프로필을 생성할 수 있습니다.
    4. 실험 시작 시간 및 이미징 시간 간격을 사용하여 시간 경과 교정 셀로 이미지 슬라이스에서 시간(startTime,interval)값까지 프레임(totalFrames) 값을 보정합니다.totalFrames 트랙 지속 시간 필터 셀을 사용하여 실험의 마지막 20h(16-36 HPI)에 걸쳐 확장되지 않는 추적을 필터링하여 부분 포함 읽기를 제외합니다.
    5. 할당 처리 셀을 사용하여 실험 조건에 의해 개별 데이터 프레임으로 트랙을 분리합니다. 성장 셀용 필터를 사용하여 충분한 성장을 나타내는 포함을 필터링합니다. 성장을 위한 필터 셀에서, 마지막 두 줄 의 코드 내에서 값을 변경하여 유오무도회 채널에 대한 형광 강도 임계값을 경험적으로 설정합니다. 이것은 성장하지 않은 클라미디아를 필터링합니다.
      참고: 임계값 필터를 설정할 때 필터가 너무 낮으면 산란 플롯이 시즈화되 필터링이 너무 높게 설정되면 중요한 돌연변이가 제거될 수 있습니다.
    6. 돌연변이 트랙의 수를 모의 처리 트랙/웰의 수로 나누어 EMS에 의한 퍼센트 사망률을 계산합니다. 모의 처리 트랙의 수를 3의 초기 희석 계수로 곱하여 모의 처리 트랙/웰수를 계산합니다. 포함 카운트 트랙을 사용하고 퍼센트 사망률 셀을 계산하여 이 작업을 수행합니다.
    7. 계산 셀을 사용하여 각 트랙의 초기 및 후반 기자 모두에 대해 반 최대 식으로 시간을 계산합니다. 이러한 값은 돌연변이 및 모의 집단을 비교하여 발달 돌연변이를 식별하는 데 사용됩니다.
    8. 하프 맥스 플롯 셀 내에서 보케 플롯 패키지를 사용하여 각 프로모터의 하프 최대 발현에 대한 시간을 시각화하여 hctB무도회에 대해 euo무도회 시간을 반 최대 식으로 그래프로 지정합니다. 보케 인터랙티브 트랙 ID 탐색기를 사용하여 모의 처리 된 분산 구름 외부에 있는 돌연변이 모집단의 포함을 식별합니다. 관심 의 포함의 FOV 및 XY 좌표를 기록합니다(그림 2).
      참고: 각 복제본에 대한 검증 및 통계 평가가 이후에 수행될 때 제어 클라우드 외부에 시각적으로 떨어진 후보 포함을 선택합니다.
    9. 애니메이션 플롯 셀 내에서 플롯 도구플롯(16)을사용하여 hctB무도회에 대한 euo무도회의 발현 강도를 그래프로 그래프로 하여 시간이 지남에 따라 프로모터 발현 운동제의 변화를 동적으로 시각화한다. 플롯의 산란 기능은 시간이 지남에 따라 유전자 발현을 애니메이션하는 데 사용된다(비디오1).
    10. 포함 로케이터 셀에서 플롯 애니메이션 그래프에서 스냅샷을 시각화하여 보케 패키지를 사용하여 특정 시점(예: 28 HPI)에서 euo무도회 및 hctB무도회 발현을 플로팅합니다(그림3). 3.3.8 단계에서 설명된 바와 같이 돌연변이 집단의 포함을 식별합니다.
      참고: 이 분석은 포함이 여전히 팽창하고 감염 후 ~ 48 h를 lyse 시작하므로 신속하게 수행되어야합니다 (&4 h).
  4. 관심의 포함으로부터 발달 돌연변이를 분리
    참고: 클라미디아를 변경된 유전자 조절을 표시하기로 결정한 개포로부터 열화하기 위해 모세관 바늘을 사용한 미세 조작기를 사용하였습니다. 관심 있는 포함의 웰 ID, FOV 및 X,Y 좌표는 섹션 3.3의 데이터 시각화를 사용하여 결정되었다.
    1. 모세관 관의 중심을 화염에 담고 모세혈관의 양쪽 끝을 분리할 때까지 당겨모세혈관 바늘을 준비한다. 현미경 슬라이드에 당겨진 팁을 부수어 당겨진 모세관 바늘의 개구부를 만듭니다. 바늘을 부러뜨리려면 현미경 슬라이드의 서리가 내린 부분에 닫힌 팁을 비스듬히 놓고 압력을 가합니다.
      참고: 모세관 튜브 사양은 1.0mm O.D., 0.5mm I.D.
    2. 바늘 개구부가 현미경, 20배 목표 하에서 대략 포함의 크기임을 확인한다.
    3. 사전 풀 ~25-30 모세관 바늘 후보 포함의 격리 (포함 당 하나의 바늘).
    4. 마이크로인젝터를 미네랄 오일로 채우면 기포가 존재하지 않습니다.
    5. 마이크로인젝터에 유리 모세관 바늘을 부착하고 바늘 끝에 기름을 추방하여 기포를 소모합니다. 모세관 바늘을 완전한 미디어에 놓고 미디어를 중간까지 끌어들입니다. 모세관 바늘을 매체로 채우는 것은 우물의 오일 오염을 방지합니다.
    6. 2.3.5 단계에서 저장된 위치 목록을 사용하여 파이썬 시각화 노트북에 식별된 관심 포함의 우물 및 FOV로 마이그레이션합니다.
    7. 마이크로 조작기의 조이스틱을 사용하여 모세관 바늘을 관심 의 포함의 XY 좌표에 국한하십시오.
    8. 595nm 여기 채널을 사용하여 추출용 EB와 바늘 시각화를 위한 위상/DIC 백색광 채널을 시각화합니다. 모세관 바늘을 포함시키기 위해 기동한 다음, 포함을 파열한 다음 마이크로인젝터를 사용하여 모세관 바늘로 EB를 그립니다.
    9. 2.1.2 단계에서 제조된 24개의 잘 된 폴리스티렌 플레이트의 단일 우물로 모세관 바늘에서 EB를 추방한다. 모세관 바늘을 제거하고 다음 포함 추출을 위해 신선한 모세관 바늘로 대체하십시오. 모든 후보 포함에 대해 3.4 를 반복합니다.
      참고: 확장 및 재이미징을 위한 충분히 높은 티터를 보장하기 위해, 대부분의 숙주 세포가 감염될 때까지 돌연변이가 5% CO2,37°C 인큐베이터로 분리된다(~1주). 다른 격리가 다른 성장률을 나타낼 수 있으므로 우물을 면밀히 모니터링해야 합니다.
  5. 수확 돌연변이 분리
    1. 얼음에, 1 mL 마이크로 파이펫 팁으로 긁어 감염된 단층을 방해. 매체, 세포 파편을 전송하고, 클라미디아를 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 방출했습니다.
    2. 4°C에서 30분 동안 원심분리로 펠릿 클라미디아, >14,000 x g. 상체를 제거하고 얼음 차가운 1x SPG의 75 μL에서 펠릿을 다시 분리합니다. 알리쿼트에서 1.5mL 스크류 캡 마이크로센티심분리기 튜브로 전환. -80 °C에 보관하십시오.

4. 돌연변이 분리 표현형 의 검증

  1. 화상 진찰 돌연변이 격리된 격리를 위한 호스트 세포 배양
    1. 전체 매체의 100 μL에서 잘 1.6 x 104 코스-7 셀(ATCC)을 가진 96개의 유리 바닥 플레이트를 시드합니다. 5% CO2,37°C에서 배양. 세포는 약 24 시간에서 합류에 도달해야합니다. 세포가 컨실루인 후 미디어를 1 μg/mL 사이클로헤시미드로 보충한 완전한 매체로 교체하고 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 현상 확인을 위해 후보 격리와 세포를 감염
    1. 얼음에 돌연변이 클론과 야생 형 클라미디아를 해동.
    2. 준비된 96 웰 플레이트에서 격리당 하나의 컬럼(11열)을 사용하여 돌연변이 분리물의 2배 연속 희석을 수행합니다. 100 μl HBSS에서 1:20의 초기 희석으로 시작합니다.
      참고: 클라미디아의 직렬 희석은 돌연변이 샘플이 MOI & lt; 1에서 이미지되도록 하기 위해 수행됩니다.
    3. MOI ~0.5에서 야생형 클라미디아로 나머지(12번째) 컬럼을 감염시다.
      참고: 야생형 클라미디아는 돌연변이 격리된 분리에 대한 비교를 위한 대조군으로 사용됩니다.
    4. 37 °C에서 15 분 동안 흔들수 있습니다.
    5. 감염된 숙주 세포를 예열된 (37°C) HBSS로 세척하여 2.2항에 명시된 바와 같이 헤파린 및 HBSS의 1 mg/mL로 세척한다.
    6. 미리 따뜻해진(37°C) 이미징 매체의 웰당 200 μL로 교체하십시오.
    7. 사전 동포 (37 °C) deionized H2O로 인터웰 공간을 채웁니다.
    8. 10 시간 동안 5 % CO2,37 ° C에서 배양하십시오.
  3. 현미경 설정
    참고: 현미경 설정의 경우 섹션 2.3을 참조하면 이 섹션에는 필요한 설정 수정만 포함됩니다.
    1. HCS 플러그인에서 96 웰 플레이트 템플릿을 선택합니다.
    2. 각 돌연변이 분리에 대해 MOI & lt; 1에 해당하는 우물을 경험적으로 결정합니다. euo 프로모터를 제어하에 클로버 발현은 ~10 HPI에서 관찰할 수 있어 포함물의 초기 시각화가가능합니다(도 1B).
    3. MOI & 1에 해당하는 돌연변이 분리당 3개의 우물을 선택하고 웰당 2개의 FOV로 구성된 이미징 위치 목록을 생성합니다.
      참고: 하드웨어 제약으로 인해 시간 간격당 72개의 이미지만 촬영할 수 있으며, 이는 12개의 샘플이 이미지화될 경우 2개의 이미징 사이트를 사용하여 균주당 3개의 희석(우물)에 해당합니다.
    4. 12HPI에서 시작하여 30분 간격으로 각 돌연변이 분리의 발달 주기를 36시간 동안 기록합니다.
    5. 수집 댓글 상자에 실험 정보를 기록합니다. 즉, 잘 ABC1 : 야생 형 제어. 잘 ABC2 : 돌연변이 변형 1, ABC3 : 돌연변이 변형 2, 등 ... 이미징: 12-48 HPI.
    6. 12HPI에서 이미지 수집을 시작합니다.

5. 검증 격리를 위한 데이터 분석

  1. 포커스 이미지 스택 생성 및 개별 포함에서 형광 식 정량화
    1. 섹션 3.1 - 3.2에 지정된 대로 각 포함에 대해 형광 강도 추적을 생성합니다.
  2. Ctr 돌연변이 격리 격리 확인
    참고: 돌연변이 격리의 변경된 개발 프로파일을 확인하려면 표현식 프로파일이 Python 노트북을 사용하는 야생식 식 프로파일과 비교됩니다. 변경된 발달 프로그래밍을 사용한 돌연변이 클론의 검증에 사용되는 파이썬 노트북은 보충데이터(clone_check-Markdown)에제공됩니다.
    1. 섹션 3.3에서 와 같이 clone_check-마크다운 파이썬 노트북에서 포함 추적 데이터를 가져오고 필터링합니다.
    2. 평균 및 STD 셀 계산을 사용하여 각 분리 및 야생형 대조군 모집단의 추적에서 평균 및 표준 편차(STD)를 계산합니다.
    3. 그래프 Iso 대 WT 셀 플롯을 사용하면 야생형 대조군에 대한 각 돌연변이 클론의 평균 및 표준 오차(SEM)를 플롯하여 돌연변이 식 운동제가 야생형 샘플(도4)과다른지 여부를 결정한다.
    4. 격리된 돌연변이 체밀이 돌연변이 추적을 플로팅하고 3.3(단계 3.7-3.3.10)(도 2, 도 3)에서수행한 분산 플롯을 사용하여 야생형 포함 추적과 비교하여 복제되는지 확인합니다. 격리가 혼합 된 인구인 경우 플롯은 야생 형으로 오버레이 한 인구와 야생 형 산란 구름 외부의 두 번째 별개의 인구를 보여줍니다. 인구가 혼합된 것처럼 보이는 경우 3.4절에 설명된 원래 절차를 사용하여 돌연변이를 다시 격리할 수 있다.
      참고: 분리의 발달 프로파일이 야생형과 통계적으로 다른지 확인하려면 각 분리에 대한 곡선이 ANOVA를 사용하여 야생형과 비교되어야 합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 프로모터 기자 클라미다이얼 균주의 직접 EMS 돌연변이 발생은 감염도에 있는 ~75% 감소귀착되었습니다. 설명된 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 사용하여 ~ 600개의 포함이 24시간 동안 이미지화되고 추적되었다. 각 포함에서 두 기자의 형광식 역학은 사용자 정의 파이썬 노트북 스크립트를 사용하여 시각화되었습니다. 격리를 위해 후보 돌연변이 클라미디아를 식별하기 위해 두 가지 시각화 접근 법이 구현되었습니다. 제1 방법론(step 3.3.8)은 대화형 산란 플롯(그림2)에서분리된 개별 클라미톨리텍으로부터 의 한발최대발현을 시각화한다. hctB 모의 처리된 분산 구름 밖에 떨어졌을 때 포함물이 격리된 것으로 확인되었습니다. 후보 클론은 시각적으로 제어 클라우드 의 외부에 떨어졌다 선택되었다. 각 클론에 대한 확인은 이후에 수행되었다. 클론 A3-6-67 및 B3-8-58은 유오 프로모터로부터 반 최대발현까지...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

클라미온 발달 주기를 제어하는 메커니즘을 해부하는 것은 현재 사용 가능한 유전 도구의 한계에 의해 방해되었습니다. 우리의 프로모터 기자 클라미디아를 사용하여 살아있는 세포 자동화 현미경 검사법과 함께, 24 시간 동안 개별 포함에 세포 형 발달의 모니터링을 가능하게 하는 시스템이 만들어졌습니다. 이러한 시스템은 화학돌연변이발생 및 직접 포괄 분리와 함께 변경된 발달프로파일(그림 5)을발현하는 클라미디아를 신속하고 복제하여 선택하는 방법을 확립하였다.

클라미얼 EB는 세포 내 이온 조건 및 에너지 원5,,12를제공할 때 호스트 외부에서 대사적으로 활성화된다. 이 EB 축균 물질 대사는 숙주 세포 밖에서 정제 된 EB를 돌연변이시키는 데 활용되었습니다. 이 프로토콜에서, EB를 대사하는 것은 E...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 CIP-1 도끼 미디어를 공급 워싱턴 주립 대학의 앤더스 옴슬랜드 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01AI130072, R21AI135691 및 R21AI13617에 의해 지원되었다. 추가 지원은 아이다호 대학과 NIH 보조금 P20GM104420을 통해 복잡한 상호 작용을 모델링하기위한 센터에서 시작 기금에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 폴리스티렌 플레이트Corning3524분리물의 재감염을 위한 세포 배양 성장
6웰 유리 바닥 플레이트CellvisP06-1.5H-N이미징을 위한 세포 배양 성장
96웰 유리 바닥 플레이트Nunc165305이미징을 위한 세포 배양 성장
볼드 라인 CO2 유닛OKO LabsCO2 UNIT BL스테이지 인큐베이터 CO2 제어
Bold line T UnitOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUS스테이지 인큐베이터 온도 제어
붕규산 유리 모세관Sutter InstrumentB1005010모세관
BrightLine 대역통과 방출 필터(514/30nm)SemrockFF01-514/30-25형광 필터 큐브
BrightLine 대역통과 방출 필터(641/75nm)SemrockFF02-641/ 75-25형광 필터 큐브
CellTram VarioEppendorf5196000030Microinjector
Chlamydia trachmatis, serovar, L2ATCC, VR-577Chlamydia trachomatis
, CIP-1 mediaIn houseNAAxenic media. IPB는 1% FBS, 25 &mu로 보충되었습니다. M 아미노산, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT 및 50 μ M GTP, UTP 및
CTP. (Omsland, A. 2012) 사내에서 제작.
Cos-7 세포 (ATCC)ATCCCRL-1651아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (숙주 세포)
CycloheximideMP Biomedicals194527숙주 세포 성장 억제제
에틸 메탄 설포 네이트, 99 %Acros 유기물AC205260100연변이
유발 태아 플렉스Gemini Bio-Products100-602기본 성장 매체 보충
자료 피지/ImageJhttps://imagej.net/FijiNAOpen Sourse 이미지 분석 소프트웨어. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubatorEppendorfCO1700100XCell culture incubation
gblocks (형광 FP 변형체: Clover 및 mKate2)Integrated DNA TechnologiesNA로 클로닝하기 위한 Ctr 최적화 FP 변이의 ORF
15710-064성장 배지용 항생제
HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)Corning21-020-CM숙주 세포 린스
헤파린 나트륨Amersham Life Science16920숙주 세포와 EB
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01성장 배지용 pH 완충액
InjectManEppendorf5179 000.018Micromanipulator
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NA포함 추적 시각화.https://jupyter.org/
Lambda 10-3셔터 기기LB10-3필터 휠 컨트롤러
Oko TouchOKO LabsOko TouchInterface 볼드 라인 T 및 CO2 장치 제어를 위한
XY 단계이전H107전동 XY 현미경 스테이지
PrismR 원심분리기LabnetC2500-R온도 제어 마이크로 원심분리기
프로블로 혼성화 오븐LabnetH1200A락킹 인큐베이터 클라미디아
감염 Proscan II이전H30V4XYZ 현미경 스테이지 컨트롤러
정수기 클래스 2 생물 안전 캐비닛Labconco362804세포 배양 작업
RPMI-1640 (페놀 레드 없음)Gibco11835-030이미징용 기본 성장 배지
RPMI-1640 (페놀 레드)GE Life SciencesSH30027.01기본 성장 매체
스코프LED 여기 LED (470nm,595nm)스코프LEDF140여기 광
음파 분석기 모델 500Fisher Scientific15-338-550초음파 처리기, 재현 탁제 클라미디아 펠렛
스테이지 인큐베이터OKO LabsH301-K-FRAME클러스터 웰 플레이트 배양 챔버
자당-인산염-글루타메이트 완충액 1X (SPG)사내NA클라미디아 저장 완충액. (10mM 인산나트륨[8mM K 2HPO 4, 2mM KH 2PO 4], 220mM 자당, 0.50mM L-글루탐산, pH 7.4)
T-75 플라스크Thermo Scientific156499세포 배양 성장
TE 300 도립 현미경Nikon16724현미경
THOR LEDThor LabsLEDD1B백색광
트립신Corning25-052-CI플레이트에 파종하기 위해 플라스크에서 숙주 세포 제거
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3이미징 카메라
&마이크로; Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNAOpen 소스 자동 현미경 제어 소프트웨어 패키지
, , , , , , , , 돌 gblock P2TK2SW2 Gentamycin 10mg/ml Gibco은 이전

참고문헌

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