여기에 설명된 이종세포를 효율적으로 감염시키기 위해 E형 간염 바이러스(HEV)의 높은 바이러스 성 티터 스톡을 생성하는 방법에 대한 효과적인 방법이 기재되어 있다. 제시된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 모두 수확하고 다양한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있다.
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방법 논문
높은 티더 E 바이러스 주식을 생산하기위한 세포 배양 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
E형 간염 바이러스는 전 세계적으로 증가하는 보급과 간 간 경변및 간 부전의 주요 원인입니다. 단일 좌초 RNA 바이러스는 주로 수혈, 부적절한 위생 조건 및 오염된 식품에 의해 전달됩니다. 현재까지 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 환자를위한 선택의 치료입니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 확인 될 남아. 지금까지 HEV 수명 주기 및 병인에 대한 지식은 효율적인 HEV 세포 배양 시스템의 부족으로 인해 심각하게 방해받고 있습니다. 강력한 세포 배양 시스템은 또한 바이러스성 병인을 포함하는 바이러스성 생활 주기의 연구 결과에 필수적입니다. 여기에 설명된 방법을 통해 최대 3 x 106 초점 성형 장치/mL(FFU/mL)의 바이러스 성 티터를 생성할 수 있으며, 봉투에 싸인 HEV의 최대 5 x 104 FFU/mL을 생성할 수 있다. 이러한 입자를 이용하여, 동물 세포주뿐만 아니라 1차 세포 및 인간을 포함한 다양한 기원의 세포를 감염시킬 수 있다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 제기, 이는이 프로토콜을 매우 효율적으로.
서론
E형 간염은 전 세계적으로 보급이 증가하는 상당히 과소 평가된 질병입니다. 대략 2천만 개의 감염은1년에70,000의 죽음 귀착됩니다. 기본 에이전트, E형 간염 바이러스 (HEV), 최근에 재할당되고 지금 제네라 Orthohepevirus 및 Piscihepevirus를 포함하여 가족 Hepeviridae 안에 분류됩니다. 다양한 기원의 HEV는 인간, 돼지, 토끼, 쥐, 조류 및 기타 포유동물2로부터분리된 것을 포함하여 종 오르토헤페바이러스 A-D 종 내에서 분류된다. 현재, 양성 지향성, 단일 좌초 RNA 바이러스의 8가지 상이한 유전자형(GT)이2로확인되었다. 그들은 그들의 순서 정체성, 전송 경로 및 지리적 분포에서 다르지만, 그들의 게놈 구조는 높게 보존됩니다. 보다 구체적으로, 7.2 kbp HEV 게놈은 3개의 주요 개방 판독 프레임(ORF1-3)으로 나뉩니다. ORF1은 숙주 세포 내에서 성공적인 복제에 필요한 모든 효소를 인코딩하는 동안, ORF2는 캡시드 단백질을 인코딩하고, ORF3 단백질은 전염성 입자의 조립 및 방출에 필요한 기능성 이온 채널로작동한다 3. 일단 기저 또는 어형 루멘....
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프로토콜
참고: 모든 실험은 BSL-2 조건하에서 수행됩니다. E형 간염 바이러스 RNA 또는 전염성 바이러스와 접촉하는 모든 물질은 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 4% Kohrsolin FF로 올바르게 헹구어야 합니다.
1. 플라스미드 준비
- 100 μg/mL 암피실린을 함유한 이노큐레이트 200 mL LB 배지는 전신 HEV gt3 Kernow-C1p6 서열(pBluescript_SK_HEVp6[JQ679013]54 또는 pBluescript_SK_HEVp6-G163R37)에대한 플라스미드 인코딩을 통합한 변형된 에슈리치아 대장균 JM109를 함유하고 있습니다. 영구 동요 (170 rpm)에서 37 °C에서 16 h에 대한 배양.
참고: 플라스미드 절연은 플라스미드 추출 키트를 사용하여 수행하였다(재료표참조). - 제조 프로토콜에 따라, 10 분 동안 6,000 x g및 4 °C에서 하룻밤 문화의 200 mL을 아래로 회전하고 상체를 폐기하십시오. 세균성 펠릿은 -20°C에서 냉동 및 보관할 수 있다.
- 10mL 세로지 피펫과 파이펫 맨으로 위아....
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결과
이 프로토콜에서, 우리는 높은 티터 전염성 HEVcc의 생산을 설명합니다. 첫 번째 단계는 플라스미드 DNA(pBluescript_SK_HEVp654 및 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, 도 8a)를분리하는 것으로, 그 후 제한 소화에 의해 선형화되고 체외 전사용 정제(도1)이다. 성공적인 선형화는 젤 전기포고를 사용하여 소화되지 않은 플라스미드-DNA와 비소화 플라스미드 DNA를 비교하여 검증될 수 있다. 크기 시프트 외에도 선형 형태를 나타내는 하나의 DNA 밴드만 표시되어야 합니다. 선형화는 각각 닉 원과 초응 형태를 나타내는 선형 형태 위와 아래에 있는 두 개의 다른 밴드가 완전히 감소될 때 완료됩니다(그림8b). 정제된 DNA의 수율은 150 ng/μL을 .......
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토론
플라스미드 제제를 시작으로, DNA 수율은 150 ng/μL을 초과하여 동일한 플라스미드 스톡에서 다중 선형화를 수행할 수 있어야 하며, 이는 중요한 게놈 서열의 박테리아 유발 돌연변이 발생 위험을 최소화합니다. 더욱이, 겔 전기포에 의한 완전한 플라스미드 선형화에 대한 제한 다이제스트를 확인하는 것이중요하다(도 8b). 선형화된 플라스미드 DNA의 부족은 생체 외 전사가 덜 효율적이도록 하는 롤링 원 증폭을 유도할 것입니다. 또한, RNA 무결성은 샘플 내의 RNases의 풍부성을 평가하기 위해 확인되어야한다(도 8c). 그런 다음에야 표적 세포의 전기화를 고려해야 합니다. 참고, HepG2 세포의 준비로 시작 하기 전에, 모든 손에 잘 준비 된 긴 대기 기간을 피하기. 특히, 전기화까지 세포와 RNA의 짧은 저장을 보장한다. 전기 기공 하는 동안 세포의 가열을 우회 하는 것은 사전에 얼음에 버퍼를 냉각 하는 것이 필수적.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 E형 간염 바이러스 p6 클론에 대한 수잔 에머슨에 감사드립니다. HEV 특이토끼 하이퍼면역 혈청은 독일 프리드리히 로플러 연구소인 라이너 울리히(Rainer Ulrich)가 친절하게 제공했습니다. 또한, 우리는 그들의 지원과 토론에 대한 루르 대학 보훔에서 분자 및 의학 바이러스학과의 모든 구성원에게 감사드립니다. 도 1-7은 BioRender.com 생성되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 & 마이크로; m mesh | Sarstedt | 83.1826 | 수확 세포 외 바이러스 |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | 면역 형광 |
| 아세트산 | CarlRoth | 6755.1 | 콜라겐 작업 용액 |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | 바이러스 수확 |
| 암피실린 | 시그마 - 알드리치 | A1593 | 변형 선택 |
| 박테리아 ATP | Roche | 11140965001 | in vitro 전사 및 electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R 용액 0.4 % 멸균 | Serva | 47256.01 | 콜라겐 작업 용액 |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro 전사 |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
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| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | P2077 | in vitro transcription |
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| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco 10270106 | Cell culture | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
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| Gentamycin | gibco | 15710049 | 세포 배양 |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro 전사 |
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| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis 분광 광도계 NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA 농도 |
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| 에 포함됨NucleoSpin 플라스미드 키트 | Macherey & Nagel | 740588.250 | 플라스미드 제제 |
| NucleoSpin RNA 클린업 키트 | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco 70011051 | Cell culture | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | 세포 배양 |
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참고문헌
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology
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