방법 논문

허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법

DOI:

10.3791/61378

⸱

2020년 9월 11일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.

초록

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MicroRNA(miRNA)는 다양한 질병 상태에 관여하며 생쥐의 질병 조기 진단 및 치료를 위한 효과적인 바이오마커입니다. 그러나 급성 신장 손상(AKI) 마우스의 신장에서 miRNA의 정제 및 발현 검출을 위한 표준 프로토콜은 잘 확립되지 않았습니다. 이 연구는 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 사용하여 신장 허혈-재관류에 의해 유도된 AKI 마우스 모델의 신장에서 miRNA를 정제하고 정량화하기 위한 효과적이고 간단한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 1) 신장 허혈-재관류에 의한 AKI 유도, 2) 신장 적출, 3) 신장에서 miRNA를 포함한 전체 RNA 정제, 4) miRNA의 역전사에 의한 cDNA 합성, 5) miRNA 발현을 검출하기 위한 qRT-PCR의 5단계로 구성됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 경증에서 중증의 AKI로 신장 허혈-재관류 손상 모델을 생성할 수 있습니다. 또한 절차를 올바르게 따르면 개체 차이가 최소화된 일관된 AKI 모델을 얻을 수 있습니다. 이 qRT-PCR assay는 매우 넓은 dynamic range를 보여주며 높은 특이성으로 정확하게 정량화할 수 있는 mature miRNA를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 AKI 신장에서 miRNA 발현 프로파일을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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신장의 허혈-재관류 손상(IRI)은 급성 신장 손상(AKI) 발병의 주요 위험 요인 중 하나이다1. AKI는 환자의 예후에 중요한 역할을 하지만, 구체적인 치료법과 조기 진단 바이오마커는 확립되지 않았습니다.

MicroRNA(miRNA)는 약 18-25개의 염기를 가진 짧고 코딩되지 않은 RNA입니다. miRNA는 체액에서 안정적이며, 그 서열은 동물에서 매우 보존되어 있습니다2. MiRNA는 수천 개의 표적을 통해 여러 단백질의 발현을 조절하여 다양한 신호 전달 경로에 영향을 미칩니다 2,3,4,5,6,7,8. 최근 몇 년 동안 miRNA는 다양한 질병 상태에 관여하며 여러 질병의 조기 진단에 효과적인 바이오마커인 것으로 보고되었습니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 IRI에 의해 유도된 AKI 마우스 모델의 신장에서 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출하는 것입니다. 이 IRI 모델은 AKI와 신장 섬유증에 널리 사용되는 모델입니다. IRI 모델의 장점은 허혈-재관류가 이루어졌는지 여부를 육안으로 확인하고 정확한 AKI 발병 시간을 결정할 수 있다는 것입니다. 그러나 광범위한 세뇨관 손상을 일으킬 수 있을 만큼 충분히 긴 클램프 지속 시간은 높은 사망률과 관련이 있는 반면, 짧은 클램프 지속 시간은 세뇨관 손상을 일으키지 않으므로 이 실험 모델에서 세뇨관 손상 진행에 큰 변화가 있습니다. 양측 클램핑 모델과 비교했을 때, 편측 신장 IRI 모델에서 적출된 우측 신절제술 조직이 대조군 역할을 하여 신부전을 보장합니다.

신장 샘플은 유리 균질기를 사용하여 으깨지며, 여기서 단백질과 핵산은 분리되고 DNA와 RNA는 분리됩니다9. miRNA를 포함한 총 RNA는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼9를 사용하여 신장 샘플에서 정제됩니다. 그 후, poly(A) 중합효소 및 oligo-dT 프라이머10을 사용하여 총 RNA에서 cDNA 합성(역전사)을 수행합니다. 마지막으로, miRNA 발현은 intercalating dye10을 사용하여 qRT-PCR에 의해 결정됩니다. qRT-PCR은 종말점에서 증폭 부피의 PCR에 비해 유전자 발현을 더 정확하게 정량화할 수 있습니다. qRT-PCR은 고농도를 측정하고 넓은 동적 범위를 특징으로 하여 사이클 수에 따라 정확한 정량화가 가능합니다. 이전 연구에서는 간단한 프로세스를 사용하여 조직에서 miRNA를 효과적으로 정제하고 검출할 수 있다고 보고했습니다 8,9,10. cDNA 합성(역전사) 및 intercalating dye를 사용한 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현 검출을 위한 이 프로토콜에 설명된 방법은 높은 정확도와 감도를 보여주는 것으로 보고되었습니다10.

또한 이 프로토콜은 간단하며 실험실 간에 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 마우스 AKI 신장에서 매우 정확하고 민감한 miRNA 검출이 필요한 연구에 유용합니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. IRI 모델

참고: 절차 전반에 걸쳐 저체온증, 장 보습 및 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링하십시오.

  1. 이소플루란에 흠뻑 젖은 면이 들어 있는 50mL 원심분리 튜브, 가열된 수술용 패드, 인산염 완충 식염수(PBS)가 함유된 페트리 접시, 수술용 가위 및 집게를 준비합니다. PBS를 37°C로 유지합니다.
    참고: 이 IRI 모델은 온도, 습도 및 12시간의 명암 주기가 제어된 방에 보관된 수컷 C57BL/6 마우스(9주, 20-25g)를 사용하여 생성되었습니다.
  2. 이소플루란을 사용하여 동물을 마취합니다: 유도 농도 3%-5%, 유지 농도 2%-3%, 클램핑 중 농도 1%-1.5%. 반사 신경의 상실에 의한 마취의 깊이를 확인한다. 흡입 마취는 시간을 조절할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 절차는 신장을 둘러싼 조직의 각질 제거로 인해 상당한 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나 흡입 마취의 단점은 체온이 떨어지기 쉽다는 것입니다. 시술 전반에 걸쳐 불필요한 마취를 피하십시오.
  3. 마취된 마우스를 등에 있는 가열된 수술 패드에 장착하고 절개 부위를 둘러싼 털을 제거한 다음 마우스의 복부 피부에 70% 에탄올을 분사합니다.
  4. 복부 피부, 근육, 복막의 정중선을 가위와 집게를 사용하여 절개합니다.
  5. PBS를 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 외강의 왼쪽으로 부드럽게 밀어 오른쪽 신장과 요관을 노출시킵니다. 시술 시간이 길면 수술 후 장 손상이 발생할 수 있습니다. 따라서 시야를 얻을 수 있을 때 복강에서 장을 제거하지 않고 수술하는 것이 좋습니다. 장을 건조하게 만들지 마십시오. 마른 면봉이나 거즈는 장 손상을 일으킬 수 있습니다.
  6. 각진 집게로 오른쪽 요관을 들어 올립니다. 4/0 실크 브레이드 봉합사를 사용하여 오른쪽 요관을 두 번 접합합니다. 봉합사 사이를 잘라 신장에 더 가까운 봉합사를 더 오래 남겨둡니다.
  7. 남은 봉합사를 너무 많이 당기지 않도록 조심스럽게 잡고 신장을 따라 결합 조직과 지방을 퉁퉁 절부합니다. 뒤에서 수술을 하면 간 손상의 위험을 줄일 수 있습니다.
    1. 신장 동맥과 정맥 외에 오른쪽 신장에 혈액을 공급하는 혈관을 확인한 다음 결찰하거나 클립합니다. 오른쪽 신장이 충분히 분리되면 4/0 실크 브레이드 봉합사를 사용하여 오른쪽 신장 동맥과 정맥을 접합합니다. 봉합하는 대신 지혈 클립을 사용하십시오.
    2. PBS를 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 외강의 오른쪽으로 부드럽게 밀어 왼쪽 신장을 드러낸 다음 촉촉한 드레이프로 장을 덮어 건조를 방지합니다. 왼쪽 신장 주위의 결합 조직과 지방을 절개합니다.
  8. 신장 동맥과 정맥 외에 왼쪽 신장에 혈액을 공급하는 혈관을 확인한 다음 결찰하거나 잘라냅니다. 신장 동맥과 신장 정맥을 고정하여 왼쪽 신장 허혈을 유발합니다. 신장 실질의 손상을 방지하기 위해 지혈 클립을 신장에서 약 1cm 떨어진 곳에 배치합니다. 성공적인 허혈은 신장이 점진적으로 균일하게 어두워짐으로써 시각적으로 확인할 수 있습니다.
  9. 장을 복강으로 되돌려 놓고 장이 뒤틀리지 않도록 주의하십시오. 복부 피부를 일시적으로 닫고 드레이프하여 습한 환경을 유지합니다. 흡입 마취의 농도를 가능한 한 낮추고 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 클램핑 시간은 25-45분입니다. 클램핑 시간이 길어질수록 심각한 신장 손상이 심해질 뿐만 아니라 장기적인 사망률도 높아집니다. 병리학 결과를 분석하여 조정합니다.
  10. 허혈 기간이 끝난 후 클램프를 제거하십시오. 혈류, 재관류 및 신장 색이 개선되는지 확인하십시오. 복부 피부를 닫기 전에 장이 뒤틀리지 않았는지 확인하십시오. 복부가 두 개의 층으로 닫히기 전에 볼륨 보충제로 PBS를 복강내 주입합니다. 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 복부 피부를 닫습니다. 신장 제거 기간이 길면 복벽과 복막을 분리하여 폐쇄함으로써 장 유착 가능성을 줄일 수 있습니다.
  11. 수술 후 감염의 위험을 최소화하려면 수술 부위에 소독제(예: 요오드/알코올 용액)를 바르십시오.

2. 신장 검체 채취

참고: 이 비디오는 24시간 후에 신장을 채취하는 45분의 클램핑 시간을 담고 있습니다.

  1. 5% 이소플루란으로 동물을 마취하고 반사 상실로 마취 깊이를 확인합니다.
  2. 복부 피부, 근육, 복막의 정중선을 가위와 집게를 사용하여 절개합니다. 27G 바늘로 구멍을 뚫은 하대정맥에서 혈액을 채취합니다.
  3. 흉벽을 정중선으로 절개하고 좌심실에 23G의 바늘을 삽입합니다. 역류를 확인합니다. 간을 절개하여 PBS 20mL를 주사합니다. 혈액이 빠져나가면서 간의 색이 빨간색에서 분홍색으로 변하는데, 이는 충분한 양의 혈액이 배출되었음을 나타냅니다.
  4. 집게와 가위를 사용하여 왼쪽 신장을 제거하고 페트리 접시에 PBS로 씻습니다. 집게를 사용하여 신장 근막을 제거하고 신장이 건조하지 않도록 주의하십시오.
  5. 신장을 반으로 자르고 반은 조직 병리학에 사용하고 나머지 반은 다음 단계에 사용합니다. 신장 골반을 피하고 신장 30mg을 채취하십시오. 사용하기 전에 -80 °C에서 보관하십시오.

3. 신장 샘플에서 miRNA 정제

참고: 여기에서 30mg 무게의 신장 샘플은 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼에서 유리 균질화기와 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화됩니다. 그 후, 신장 샘플의 miRNA는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리됩니다.

  1. 1.5 또는 2.0mL 마이크로 원심분리 튜브, 100% 에탄올, 클로로포름, 유리 균질화기, 얼음, 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼9의 바이오 폴리머 파쇄 시스템, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼9, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘 및 에탄올을 함유한 세척 완충액(세척 완충액 1) 및 에탄올을 함유한 세척 완충액(세척 완충액 2)을 준비합니다.
  2. 30mg의 신장 샘플을 유리 균질기에 넣고 700μL의 페놀/구아니딘 기반 용해 시약을 추가합니다. 조직은 열에 의해 변성되기 때문에 얼음 위에서 이 단계를 수행하십시오.
  3. 유봉을 비틀어 샘플에 천천히 눌러 신장 샘플을 균질화합니다. 신장 샘플이 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 얼음에서 이 과정을 수십 번 반복합니다. 후속 측정에서 miRNA가 얻어지지 않는 경우, 이는 불충분한 용해 때문일 수 있습니다.
  4. 추가적인 균질화를 위해 균질화된 용해물을 2.0mL 수집 튜브에 배치된 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼을 통해 바이오폴리머 파쇄 시스템으로 옮깁니다. 이것을 14,000 × g 에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.
  5. 균질화된 용해물을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  6. 균질화된 용해물에 클로로포름 140μL를 추가하고 튜브를 단단히 닫습니다. 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.
  7. 실온에서 2-3분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 12,000 × g 에서 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리하십시오.
  8. 침전물을 방해하지 않고 상층액(일반적으로 300μL)을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 100% 에탄올 1.5부피(일반적으로 450μL)를 첨가합니다. 5초 동안 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다.
  9. 최대 700μL의 시료를 2.0mL 수집 튜브에 배치된 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 피펫팅합니다. 컬럼 캡을 닫고 15,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후에는 수집 튜브의 관통 용액을 폐기합니다.
  10. 700μL의 세척 버퍼 1을 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하여 샘플을 철저히 세척합니다. 컬럼의 캡을 닫고 15,000×g에서 15 초 동안 원 심분리합니다. 원심분리 후에는 수집 튜브의 관통 용액을 폐기합니다.
  11. 500μL의 세척 버퍼 2를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하여 염의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫고 15,000 × g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후에는 수집 튜브의 관통 용액을 폐기합니다.
    1. 3.11단계를 반복합니다.
  12. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 × g 에서 1분 동안 다시 원심분리합니다. 원심분리 후에는 수집 튜브의 관통 용액을 폐기합니다.
  13. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브에 넣습니다. 25μL의 RNase-free 물을 컬럼으로 옮기고 컬럼 캡을 닫습니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 그대로 둔 다음 15,000×g에서 1 분 동안 원 심분리합니다.
  14. miRNA가 포함된 25μL 용리액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. miRNA는 반복적인 용해에 의해 분해되기 때문에 샘플을 2개 또는 3개의 튜브로 분주하는 것이 좋습니다. 사용하기 전에 -80 °C에서 보관하십시오.

4. miRNA의 역전사

참고: 여기에서 1.0μg의 분리된 RNA는 역전사효소, 폴리(A) 중합효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 역전사됩니다.

  1. 다음 항목을 준비하십시오 : 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브; 8웰 스트립 튜브; RNase-free 물; 얼음; 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 삼인산 및 올리고-dT 프라이머를 함유하는 10x 핵산 혼합물; 폴리(A) 중합효소 및 역전사효소 혼합물; 및 Mg2+, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고-dT 프라이머 및 무작위 프라이머를 포함한 활성화 완충액10.
  2. 2.0 μL의 10x 핵산 혼합물, 2.0 μL의 폴리(A) 중합효소 및 역전사 효소 혼합물, Mg2+, deoxyribonucleotides, oligo-dT 프라이머 및 무작위 프라이머를 포함한 4.0 μL의 5x 활성화 완충액을 포함하는 마스터 믹스 용액을 준비하여 튜브당 총 8.0 μL를 준비합니다.
  3. 8.0μL의 마스터 믹스 용액을 각 튜브에 분주합니다.
  4. 신장 샘플에서 정제된 1.0μg의 분리된 miRNA를 각 튜브에 추가합니다.
  5. 각 튜브에 RNase-free 물을 총 20 μL로 추가합니다. 피펫팅으로 철저히 혼합하고 1,500 x g 에서 15초 동안 원심분리합니다.
  6. 37°C에서 60분 동안 샘플을 배양한 후 즉시 95°C에서 5분 동안 배양합니다. 이 단계는 열 순환기에서 수행할 수 있습니다.
  7. cDNA를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 RNase가 없는 물로 10회(1:10) 희석합니다.
  8. 희석된 cDNA는 단기적으로 얼음에 보관하고 장기적으로는 사용하기 전에 -80°C에서 보관하십시오.

5. miRNA의 qRT-PCR

참고: miRNA의 qRT-PCR은 삽입 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에서는 U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p, miRNA-574-5p에 대한 프라이머를 사용하였다.

  1. 1.5mL 미세원심분리 튜브, qRT-PCR용 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, miRNA 특이적 프라이머, Taq DNA 중합효소, PCR 완충액, 데옥시뉴클레오티드 및 범용 프라이머10으로 구성된 PCR 마스터 믹스 및 Real-Time PCR 기기를 준비합니다.
  2. 12.5 μL의 2x PCR Master Mix, 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 각 miRNA 프라이머(5 μM) 2.5 μL, 각 웰에 대해 10x 범용 프라이머 1.25 μL를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다.
  3. 22.5μL의 마스터 믹스를 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
  4. 각 웰에 2.5μL의 템플릿 cDNA를 추가합니다.
  5. 96웰 반응 플레이트용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 그런 다음 1,000×g에서 30 초 동안 플레이트 를 원심분리합니다.
  6. Real-Time PCR 기기 및 소프트웨어를 사용하여 다음과 같이 PCR 사이클링 프로그램을 실행합니다.
    1. Real-Time PCR 기기에 플레이트를 놓습니다. Real-Time PCR 소프트웨어를 사용하여 샘플에 이름을 할당하고 각 웰에서 miRNA를 타겟화합니다.
    2. 지침에 따라 Real-Time PCR 소프트웨어에 다음 PCR 사이클링 조건을 입력합니다: 95°C에서 15분 동안 사전 배양한 다음 94°C에서 15초 동안 변성 40주기, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 70°C에서 30초 동안 연장.
  7. Real-Time PCR 기기의 소프트웨어를 사용하여 qRT-PCR 데이터를 분석합니다. 비특이적 반응을 확인합니다. Dissociation curve 또는 Melt curve를 분석하여 의도한 증폭 이외의 증폭이 발생하지 않았는지 확인합니다.
    1. 타겟 miRNA의 발현 수준을 내인성 대조군으로 RNU-6로 정규화합니다. 2-ΔΔCT 방법11을 사용하여 타겟 miRNA의 상대적 발현 수준을 계산합니다.

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결과

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여기서, AKI 마우스의 miRNA 발현 프로파일을 조사하였다. miRNA 발현 프로파일은 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 조사되었습니다. MiRNA는 중요한 전사 후 조절자이며 현재 AKI를 포함한 다양한 질병의 특성화에서 광범위하게 연구되고 있습니다. MiRNA는 병리학적 상태를 밝히고 AKI12 치료에 적용할 수 있는 잠재력이 있습니다. AKI의 주요 원인은 IRI, 신독성 모욕 및 패혈증입니다. 신장의 IRI는 AKI 발병의 주요 위험 요인 중 하나입니다. 수많은 miRNA가 AKI13에 관여하는 것으로 보고되었습니다.

이 연구는 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 패혈증 및 IRI 모델에서 일반적으로 변경되는 miRNA를 조사했습니다. 마이크로어레이 분석에 의해 AKI 마우스의 신장에서 상향 조절되는 것으로 나타난 17개의 miRNA를 선정하고, 인간에서 발현되는 것으로 보고된 이러한 ...

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토론

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이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여 IRI 마우스의 신장에서 추출한 miRNA를 qRT-PCR을 사용하여 성공적으로 정제 및 검출했습니다. 프로토콜에서 IRI 유도 절차의 중요한 점에는 AKI20에 영향을 미치는 것으로 알려진 체온 및 마취 농도의 신중한 모니터링이 포함됩니다. 이 프로토콜의 강점은 허혈-재관류가 이루어졌는지 여부를 시각적으로 확인할 수 있다는 것입니다. 그러나 이 IRI 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 심각한 허혈을 유발하기 위해 클램프 시간을 연장하면 사망률이 증가합니다. 또한, 좌측 신장 동맥 클램프를 사용하여 신장 허혈이 이루어지지 않는 경우, 이는 신장 동맥과 정맥 이외의 신장으로 가는 혈관이 결찰/절단되지 않았기 때문입니다. AKI를 유도하는 다른 방법으로는 약물 주사(엽산, 아리스톨로옥산, 시스플라틴, 겐타마이신, 글리세롤, L-미모신, CoCL2, 카나마이신, 푸로세...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고의 초안을 편집해 주신 Nam Nguyen 박사에게 감사드립니다.

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재료

후 나아 첨부 겸자 할당 없음 나 바이오폴리머 파쇄 시스템, , , ,

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
크 없는 벤트 팁 테이퍼 핀셋츠메 제작소MA-47
버퍼 RLTQiagen79216워시 버퍼 1
버퍼 RWTQiagen1067933워시 버퍼 2
C57B6 마우스SLC치
츠메 제작소MA-49
치아 없음 겸자나츠메 제작소MA-48-1
지혈 클립나츠메 제작소KN&-minus; 353
MicroAmp Optical qRT-PCR용 96웰 반응 플레이트Thermo Fisher Scientific431681396웰 반응 플레이트
MicroAmp 광학 접착 필름Thermo Fisher Scientific96웰 반응 플레이트용 4311971 접착 필름
miRNA-132-3p 프라이머QiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p 프라이머QiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p 프라이머QiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p 프라이머QiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p 프라이머QiagenMS000090795'UAGCUUAUCAUGAUGUUGA
miRNA-223-3p 프라이머QiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p 프라이머QiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGAGUGUGUGU
miRNeasy Mini 키트Qiagen217004실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼
miScript II RT 키트Qiagen218161
miScript SYBR Green PCR 키트Qiagen218073
QIA 분쇄기Qiagen마이크로 원심분리기 스핀 컬럼의79654
QIAzol 용해 시약Qiagen79306페놀/구아니딘 기반 용해 시약
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR 시스템, Thermo Fisher Scientific4472380실시간 PCR 기기
QuantStudio 12K Flex 소프트웨어 버전 1.2.1.써모 피셔 사이언티픽4472380실시간 PCR 기기 소프트웨어
RNU6-2 프라이머QiagenMS00033740공개 미
수술용 가위나츠메 제작소B-2
혈관 클립 어플라이어VITALITEC1621420

참고문헌

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