허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법

요약

이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.

초록

MicroRNA(miRNA)는 다양한 질병 상태에 관여하며 생쥐의 질병 조기 진단 및 치료를 위한 효과적인 바이오마커입니다. 그러나 급성 신장 손상(AKI) 마우스의 신장에서 miRNA의 정제 및 발현 검출을 위한 표준 프로토콜은 잘 확립되지 않았습니다. 이 연구는 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 사용하여 신장 허혈-재관류에 의해 유도된 AKI 마우스 모델의 신장에서 miRNA를 정제하고 정량화하기 위한 효과적이고 간단한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 1) 신장 허혈-재관류에 의한 AKI 유도, 2) 신장 적출, 3) 신장에서 miRNA를 포함한 전체 RNA 정제, 4) miRNA의 역전사에 의한 cDNA 합성, 5) miRNA 발현을 검출하기 위한 qRT-PCR의 5단계로 구성됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 경증에서 중증의 AKI로 신장 허혈-재관류 손상 모델을 생성할 수 있습니다. 또한 절차를 올바르게 따르면 개체 차이가 최소화된 일관된 AKI 모델을 얻을 수 있습니다. 이 qRT-PCR assay는 매우 넓은 dynamic range를 보여주며 높은 특이성으로 정확하게 정량화할 수 있는 mature miRNA를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 AKI 신장에서 miRNA 발현 프로파일을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

신장의 허혈-재관류 손상(IRI)은 급성 신장 손상(AKI) 발병의 주요 위험 요인 중 하나이다¹. AKI는 환자의 예후에 중요한 역할을 하지만, 구체적인 치료법과 조기 진단 바이오마커는 확립되지 않았습니다.

MicroRNA(miRNA)는 약 18-25개의 염기를 가진 짧고 코딩되지 않은 RNA입니다. miRNA는 체액에서 안정적이며, 그 서열은 동물에서 매우 보존되어 있습니다². MiRNA는 수천 개의 표적을 통해 여러 단백질의 발현을 조절하여 다양한 신호 전달 경로에 영향을 미칩니다 2,3,4,5,6,7,8. 최근 몇 년 동안 miRNA는 다양한 질병 상태에 관여하며 여러 질병의 조기....

프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. IRI 모델

참고: 절차 전반에 걸쳐 저체온증, 장 보습 및 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링하십시오.

1. 이소플루란에 흠뻑 젖은 면이 들어 있는 50mL 원심분리 튜브, 가열된 수술용 패드, 인산염 완충 식염수(PBS)가 함유된 페트리 접시, 수술용 가위 및 집게를 준비합니다. PBS를 37°C로 유지합니다.
   참고: 이 IRI 모델은 온도, 습도 및 12시간의 명암 주기가 제어된 방에 보관된 수컷 C57BL/6 마우스(9주, 20-25g)를 사용하여 생성되었습니다.
2. 이소플루란을 사용하여 동물을 마취합니다: 유도 농도 3%-5%, 유지 농도 2%-3%, 클램핑 중 농도 1%-1.5%. 반사 신경의 상실에 의한 마취의 깊이를 확인한다. 흡입 마취는 시간을 조절할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 절차는 신장을 둘러싼 조직의 각질 제거로 ....

결과

여기서, AKI 마우스의 miRNA 발현 프로파일을 조사하였다. miRNA 발현 프로파일은 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 조사되었습니다. MiRNA는 중요한 전사 후 조절자이며 현재 AKI를 포함한 다양한 질병의 특성화에서 광범위하게 연구되고 있습니다. MiRNA는 병리학적 상태를 밝히고 AKI¹² 치료에 적용할 수 있는 잠재력이 있습니다. AKI의 주요 원인은 IRI, 신독성 모욕 및 패혈증입니다. 신장의 IRI는 AKI 발병의 주요 위험 요인 중 하나입니다. 수많은 miRNA가 AKI¹³에 관여하는 것으로 보고되었습니다.

이 연구는 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 패혈증 및 IRI 모델에서 일반적으로 변경되는 miRNA를 조사했습니다. 마이크로어레이 분석에 의해 AKI 마우스의 신장에서 상향 조절되는 것으로 나타난 17개의 miRNA를 선정하고, 인간에서 발현되는 것으로 보고된 이러한 .......

토론

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여 IRI 마우스의 신장에서 추출한 miRNA를 qRT-PCR을 사용하여 성공적으로 정제 및 검출했습니다. 프로토콜에서 IRI 유도 절차의 중요한 점에는 AKI²⁰에 영향을 미치는 것으로 알려진 체온 및 마취 농도의 신중한 모니터링이 포함됩니다. 이 프로토콜의 강점은 허혈-재관류가 이루어졌는지 여부를 시각적으로 확인할 수 있다는 것입니다. 그러나 이 IRI 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 심각한 허혈을 유발하기 위해 클램프 시간을 연장하면 사망률이 증가합니다. 또한, 좌측 신장 동맥 클램프를 사용하여 신장 허혈이 이루어지지 않는 경우, 이는 신장 동맥과 정맥 이외의 신장으로 가는 혈관이 결찰/절단되지 않았기 때문입니다. AKI를 유도하는 다른 방법으로는 약물 주사(엽산, 아리스톨로옥산, 시스플라틴, 겐타마이신, 글리세롤, L-미모신, CoCL₂, 카나마이신, 푸로세.......

재료

후 나아 첨부 겸자 할당 없음 나 바이오폴리머 파쇄 시스템, , , ,

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
크 없는 벤트 팁 테이퍼 핀셋	츠메 제작소	MA-47
버퍼 RLT	Qiagen	79216	워시 버퍼 1
버퍼 RWT	Qiagen	1067933	워시 버퍼 2
C57B6 마우스	SLC	치
	츠메 제작소	MA-49
치아 없음 겸자	나츠메 제작소	MA-48-1
지혈 클립	나츠메 제작소	KN&-minus; 353
MicroAmp Optical qRT-PCR용 96웰 반응 플레이트	Thermo Fisher Scientific	4316813	96웰 반응 플레이트
MicroAmp 광학 접착 필름	Thermo Fisher Scientific		96웰 반응 플레이트용 4311971 접착 필름
miRNA-132-3p 프라이머	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p 프라이머	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p 프라이머	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p 프라이머	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p 프라이머	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAUGAUGUUGA
miRNA-223-3p 프라이머	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p 프라이머	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGAGUGUGUGU
miRNeasy Mini 키트	Qiagen	217004	실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼
miScript II RT 키트	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR 키트	Qiagen	218073
QIA 분쇄기	Qiagen	마이크로 원심분리기 스핀 컬럼의	79654
QIAzol 용해 시약	Qiagen	79306	페놀/구아니딘 기반 용해 시약
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR 시스템	, Thermo Fisher Scientific	4472380	실시간 PCR 기기
QuantStudio 12K Flex 소프트웨어 버전 1.2.1.	써모 피셔 사이언티픽	4472380	실시간 PCR 기기 소프트웨어
RNU6-2 프라이머	Qiagen	MS00033740	공개 미
수술용 가위	나츠메 제작소	B-2
혈관 클립 어플라이어	VITALITEC	1621420