방법 논문

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

DOI:

10.3791/61383

⸱

2020년 8월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3'번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNA) - 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험 프로토콜은 지치의과대학의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 지치의과대학 실험실 동물가이드의 실험동물 사용 및 관리 지침에 따라 시행되었다.

1. 가짜 수술

  1. 이소플루란, 코르크 시트, 탈취 크림, 실험실 물티슈, 인산염 완충식살린 살린 페트리 접시(PBS), 4-0 나일론, 핀셋, 수술 가위, 면봉, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스 를 준비한다.
  2. 1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음, 마우스의 복부에 디필 크림을 바르습니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.
  3. 마우스의 복부에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 마우스 시트에 놓습니다.
  4. 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.
  5. PBS로 두 면봉을 적신 다음 내장을 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다.
  6. 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 닫습니다.

2. UUO 수술

  1. 이소플루란, 코르크 시트,....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UUO 마우스 모델은 20-25g의 8주 된 수컷 마우스에서21에 설명된 바와 같이 왼쪽 요관 결찰에 의해 만들어졌습니다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 진통제 (멜록시캠 5 mg/kg, 피하 주사) 수술 전과 수술 후 2 일 동안 매일 투여되었습니다. 수술 후 8일 동안 신장을 채취하고, PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 샴 작동 마우스는 대조군역할을 합니다. 왼쪽 신장에 수성 신증이있는 경우 이중 결찰이 성공합니다. 이러한 UUO 모델을 사용하여 얻은 miRNA qRT-PCR 데이터를 기반으로, miRNA-3070-3p의 수준이 크게 증가하여 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 수준이 대조군(도1)에비해 UUO 마우스의 신장에서 상당히 감소하였다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응 플레이트의 각 웰에 DNA 오염 또는 프라이머 이크머가 있을 수 있다.

miRNAs의 발현 수준은 마이크로어레이, 북부 블로팅 및 ribonuclease 보호 분석 방법을 포함하는 qRT-PCR 이외의 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 qRT-PCR은 정확하고 민감하며, 북부 블로팅 및 리보누벨리스 보호어마어마(22)에비해 qRT-PCR에 더 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있는 간단.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Qiagen79216세척 버퍼 2
Qiagen1067933세척 버퍼 1
Tokyo Laboratory Animals Science할당
Thermo Fisher Scientific431681396웰 반응 플레이트
Thermo Fisher Scientific431197196웰 반응 플레이트
용 접착 필름QiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004멤브레인 앵커 스핀 2.0mL 수집 튜브
Qiagen218161역전사 효소 키트
Qiagen218073Green 염료 기반 PCR 키트
Qiagen796542.0mL 수집 튜브의 바이오폴리머 스핀 컬럼
Real-time PCR 기기
Thermo Fisher Scientific4472380Real-time PCR 기기 소프트웨어
Qiagen129112
QiagenMS00033740공개
Takara Bio9790B실리콘 균질화 ASKUL
GA04SW
1ER1004NA45-KF2,62 - 9968-32
되지 않음의 컬럼 Qiagen 79306 Phenol/guanidine 기반 용해 시약 Thermo Fisher Scientific 4472380 되지 않음년

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNARNAcDNAmiRNA 3070 3pmiRNA 7218 5pmiRNA 7219 5p

관련 논문