여기에 설명된 프로토콜은 유도만능줄기세포 유래 뇌유사 내피세포의 분화, 감염을 위한 Neisseria meningitidis 준비 및 기타 분자 분석을 위한 샘플 수집의 주요 단계를 강조합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
수막구균성 뇌수막염은 나이세리아 수막염(Neisseria meningitidis , 수막구균, Nm)이 고도로 전문화된 뇌 내피 세포(BEC)에 침투하여 중추신경계(CNS)에 접근할 수 있을 때 발생하는 생명을 위협하는 감염입니다. Nm은 인간 특이적 병원체이기 때문에 강력한 in vivo 모델 시스템이 없기 때문에 Nm과 BEC 간의 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구가 어려워지고 네이티브 BEC를 모방하는 인간 기반 모델이 필요합니다. BEC는 복잡한 밀착 접합부와 높은 경내피 전기 저항(TEER)을 특징으로 하는 말초 내피 세포와 비교할 때 더 단단한 장벽 특성을 가지고 있습니다. 그러나 1차 BEC 및 불멸화된 BEC와 같은 많은 in vitro 모델은 기본 신경 미세환경에서 제거된 후 장벽 특성이 부족하거나 빠르게 손실됩니다. 최근 인간 줄기세포 기술의 발전으로 유도만능줄기세포(iPSC)에서 뇌와 유사한 내피세포를 유도하는 방법이 개발되어 다른 체외 인간 모델과 비교할 때 BEC를 더 잘 표현할 수 있습니다. Nm-BEC 상호작용을 모델링하기 위해 iPSC 유래 BEC(iPSC-BEC)를 사용하면 BEC 장벽 특성을 가진 인간 세포를 사용할 수 있다는 이점이 있으며, 장벽 파괴, 선천성 면역 활성화 및 박테리아 상호작용을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 분석을 위한 박테리아 준비, 감염 및 샘플 수집 외에도 iPSC에서 iPSC-BEC를 도출하는 방법을 보여줍니다.
서론
혈액-뇌 장벽(BBB)과 수막 혈액-CSF 장벽(mBCSFB)은 중추신경계(CNS)에서 순환을 분리하는 매우 단단한 세포 장벽이며 주로 고도로 전문화된 뇌 내피 세포(BEC)로 구성되어 있습니다1,2. BEC는 뇌 안팎의 영양소와 노폐물을 조절하고 많은 독소, 약물 및 병원균을 배제하여 적절한 뇌 항상성을 유지합니다 1,2. 세균성 뇌수막염은 혈액 매개 박테리아가 BEC에 의해 형성된 장벽과 상호 작용하고 이를 뚫고 들어가 염증을 일으킬 때 발생합니다. Neisseria meningitidis(Nm, 수막구균)는 건강한 사람의 10-10%의 비염을 집락화하는 그람 음성 박테리아이지만 경우에 따라 심각한 전신 질환을 유발할 수 있습니다3. 영향을 받은 개인에서 Nm은 자반증을 유발할 수 있는 혈류에 접근할 수 있을 뿐만 아니라 BEC를 관통하여 뇌수막염을 유발하는 중추신경계에 접근할 수 있다3. Nm은 전 세계적으로 세균성 뇌수막염의 주요 원인이며, 백신 접종 노력에도 불구하고 여전히 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 모든 배지/시약 준비, 줄기 세포 유지 및 분화 단계는 Stebbins et al.22에서 채택되었습니다.
1. iPSC 배양 및 BEC 분화에 필요한 물질 준비.
- IMR90-4 iPSC 배양을 위한 조직 배양(TC) 플라스틱의 매트릭스 코팅
- 기저막 매트릭스 겔(예: Matrigel)을 2.5mg 분취액으로 추출하고 -20°C에서 보관합니다.
알림: 매트릭스 겔과 부분 표본을 얼음 위에서 취급할 때는 4°C 이상의 겔을 형성하고 일단 응고되면 분취할 수 없으므로 신속하게 작업하십시오. - TC 플라스틱을 코팅하려면 50mL 원뿔형 튜브에 있는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12 배지 30mL에 매트릭스 겔 부분 표본 1개를 빠르게 추가합니다. 1mL의 배지를 냉동 매트릭스 겔에 추가하고 해동될 때까지 위아래로 피펫팅한 다음 나머지 배지와 함께 50mL 코니컬 튜브로 즉시 옮깁니다.
- 6웰 플레이트의 웰당 1mL의 이 매트릭스 겔 코팅 용액을 사용하고 T75 플라스크당 12mL를 사용합니다.
알림: 매트릭스 젤 코팅 TC 플라스틱은 사용하기 최대 2주 전에 준비할 수 있습니다. ....
- 기저막 매트릭스 겔(예: Matrigel)을 2.5mg 분취액으로 추출하고 -20°C에서 보관합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에 설명된 프로토콜은 Stebbins et al.에서 채택한 것으로, iPSC를 BBB 특성을 가진 뇌 유사 내피 세포로 분화하는 과정과 Nm19,22의 iPSC-BEC를 사용하는 감염 연구에 이 모델을 활용하는 방법을 강조합니다. iPSC-BEC는 적절하게 분화될 경우 TEER로 측정한 2000 Ω·cm2보다 큰 단단한 장벽 특성을 나타내며 VE-cadherin 및 CD31(PECAM)과 같은 내피 마커를 발현합니다(그림 1A\u2012C). 또한 긴밀한 접합 마커인 Claudin-5, Occludin, ZO-1(그림 1 D\u2012F)과 Glut-1(그림 1G)과 같은 수송체를 발현하고 위치를 파악합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
시험관 내 1차 및 불멸화된 인간 BEC는 강력한 장벽 표현형이 부족한 경향이 있기 때문에 BEC와 BBB를 모델링하는 데 어려움이 있었습니다. 인간 줄기 세포 기술의 출현으로 내피 마커, 단단한 접합 발현, 장벽 특성, 다른 CNS 세포 유형에 대한 반응 및 기능적 유출 수송체와 같은 예상되는 특징적인 BBB 표현형을 유지하는 iPSC 유래 BEC 유사 세포의 생성이 가능해졌습니다 12,13,14,15,22, 24 , 25. 이를 통해 연구자들은 in vivo BEC를 밀접하게 모방.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
L.M.E.는 A.S-U.에 수여된 "인간 병원체에 의한 미생물 감염 연구를 위한 3D 조직 모델"이라는 제목의 DFG 연구 교육 프로그램 GRK2157 지원을 받습니다. B.J.K.는 알렉산더 폰 훔볼트 재단(Alexander von Humboldt Foundation)의 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다. 또한, 문화 분야에서 iPSC-BEC를 생성하는 데 기술적 도움을 준 Lena Wolter에게 감사의 뜻을 전합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | 효소 세포 해리 시약 |
| 아세트산 | Sigma | A6283 | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
| Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
| Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| 세포 배양 플레이트 및 플라스크 | Sarstedt | ||
| 원심분리기(Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
| Class II 생물 안전 캐비닛 | Nuaire | NU-437-400E | |
| CO2 인큐베이터(DHD Autoflow CO2 에어 재킷 인큐베이터) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
| Costar Transwell 폴리 에스테르 필터 (12 또는 24 웰) | Corning | 3460, 3470 | |
| D (+) - 포도 | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| STX 전극이 있는 상피 전압계(Millicell ERS-2) | Merck(Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| 형광 현미경(Eclipse Ti) | Nikon | ||
| Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
| Kellogg's supplement Kellogg's supplement | 110 ml를 준비하기 위해, 포도당 4 g/ml, 글루타민 0.1 g/ml, 피로인산 티아민 0.2 mg/ml 100 ml와 5 mg/ml Fe(NO3)3 10 ml를 준비하고, 용액을 결합한다. 필터는 -20°C에서 분주물을 살균하고 보관합니다. | ||
| 녹아웃 세럼 대체품(KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-글루타민(GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA 합성 키트 |
| , Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
| 메탄올 | ROTH | 4627.5 | |
| MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
| 마이크로피펫 (Research Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| NucleoSpin RNA 분리 키트 | Machery-Nagel | 740955 | RNA 분리 키트 |
| Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
| 혈소판 불량 혈장 유래 혈청, 소 (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR 마스터 믹스 |
| qPCR 필름 (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
| qPCR 플레이트 (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
| ROCK 억제제, Y27632 디하이드로클로라이드 | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| 혈청학 피펫 | Sarstedt | ||
| StemFlex 기초 배지 + 50x StemFlex 보충제 | Gibco | A3349401 | 줄기세포 유지 배지 |
| 스윙 버킷 로터(Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| 티아민 피로인산 | 시그마 | C8754-5G | |
| 트리판 블루 솔루션, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | 비효소 세포 해리 시약(EDTA) |
참고문헌
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
