추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Summary

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

Abstract

고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및 내분비학을 연구하기위한 도구를 제공합니다. 고환 오르가노이드를 만들기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법의 대부분은 세포외 매트릭스에 의존 (ECM) 드 노보 조직 조립을 촉진하기 위해, 그러나, 생물 모방 형태와 조직의 기능 측면에서 방법 사이에 차이가있다. 또한 게시된 메서드에 대한 직접 비교는 거의 없습니다. 여기서, 직접적인 비교는 제공된 결과와 함께 오르가노이드 생성 프로토콜의 차이를 연구함으로써 이루어집니다. 4개의 고풍화 생성 방법: (1) 2D ECM 프리, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM 프리, 및 (4) 3D ECM 배양이 설명된다. 3개의 1차 벤치마크는 고환 오르간성 생성을 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이들은 세포 자기 조립, 주요 세포 모형의 포함 (세르톨리, Leydig, 세균 및 peritubular 세포), 및 적당하게 구획조직 건축입니다. 테스트된 4개의 환경 중, 2D ECM 및 3D ECM 없는 배양은 관과 간질 세포 유형의 드 노보 구획화, 튜블러 유사 구조의 개발 및 확립된 장기 내분비 기능을 포함하여 네이티브 고환과 가장 유사한 내부 형태와 함께 오르가노이드를 생성했습니다. 모든 방법은 분류되지 않은, 1 차적인 골린 고환 세포 현탁액을 활용하고 일반적으로 접근 가능한 배양 자원을 이용했습니다. 이러한 고환 기관지 생성 기술은 시험관 내 고환 기관발생 및 생리학에 대한 연구 이니셔티브를 위한 매우 접근가능하고 재현 가능한 툴킷을 제공합니다.

Introduction

고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및^생리학을연구하기 위한 선구적인 기술이다^1,2,,3,,4. 몇 가지 방법은 오르가노이드 생성을 위해 탐구되었습니다; 여기에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 방향 모두에서 다양한 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM 프리 배양 시스템이 포함됩니다. 다른 세대 방법은 별개의 세포 조립 전략을 촉진 할 수있다; 이로 인해 게시된 오르가노이드 모델 간의 높은 수준의 형태학적 및 기능적 가변성을 초래합니다. 이 문서의 목적은 시험관 내 고환 모델의 현재 상태를 논의하고 고환 오르가노이드 실험을 설계 할 때 미래의 조사자를위한 템플릿 역할을하는 것입니다. 본 연구에서는, 4개의 상이한 배양 시스템 원형이 실험 과정 및 생물학적 결과로 정의되고 특징지입니다. 여기에는 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free 및 3D ECM 배양 방법이 포함됩니다. 여기에 제시된 전략은 다른 실험실과 연구 그룹 간에 간단하고 접근 가능하며 매우 재현할 수 있도록 하기 위한 것입니다.

Protocol

모든 마우스 실험은 노스웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며, 모든 절차는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 효소 조직 해리 솔루션의 준비

1. 기저 배양 배지 솔루션(BM)을 사용하여 만들어진 두 가지 효소 솔루션(솔루션 1 및 솔루션 2)을 사용합니다.
2. BM을 준비하려면 혈청과 페니실린 연쇄 절제술을 최소 필수 매체에 각각 10%와 1%의 최종 농도에 추가합니다(특정 시약의 재료 표 참조). 그런 다음 0.22 μm 필터를 통해 BM을 걸레로 멸균하십시오. 세포와 사용하기 전에, 배양 접시에 분배하고 가습, 5 % CO₂ 인큐베이터 내에서 배치하여 중성 pH에 멸균 BM을 최소 1 h의 최소 37 ° C로 평형.
   참고 : BM은 신선한 BM을 만들어야 하는 후 최대 1 주일 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
3. 콜라게나아제 1주식용액을 제조하기 위해 먼저 1mL의 콜라게나아제 1mL를 멸균배등급_H2O(최종농도 10% m/v)로 녹이고, 반전 또는 소용돌이를 녹이고, 20μL 알리코를 -20°C에 저장하여 나중에 사용한다. 알리쿼트는 한 번만 해동해야 합니....

Results

오르가노이드 생성은 고환 세포가 배양의 72 h 이내에 자가 조립하지 않으면 실패한 것으로 간주되었지만, 여기에 제시된 모든 방법은 청소년 (5 dpp) 뮤린 세포를 사용할 때 24 시간 이내에 조립됩니다. 생물학적 구조 생성의 실패는 확장 배양(72h)이 후에도 자유롭게 중단된 세포(도 1에서0h 컬럼)의 연속으로 제시된다. 조직 자체 조립이 없는 경우, 모든 명백한 세포 클러스터는 부드러운 조작(즉, 파이펫팅)에도 따라 개별 세포로 쉽게 분산됩니다. 성공적으로 생성된 조직은 처음에 3D 셀 "클러스터"(그림 1의6h 열에 있는 노란색 화살표)로 관찰되었습니다. ECM이 없는 환경(2D 및 3D) 내에서, 이러한 구조는 특히 3D 아가로즈 페트리요리(그림 1A, C)에서문화의 처음 24h를 가로질러 "컴팩트"한 것으로 나타났습니다. ECM.......

Discussion

이 organoid 생성 프로토콜이 완료되면 사용자는 ECM 또는 ECM이 없는 환경에서 고환 구조 및 오르가노이드를 조립할 수 있는 네 가지 문화 기술을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 4가지 방법 모두를 통해 연구원은 시간 경과 화상 진찰 또는 비디오 기록을 통해 시간이 지남에 따라 비침습적으로 기관지 자기 조립을 관찰하고, 문화 도중 조직을 방해하지 않고, 분비한 호르몬과 사이토카인의 분석을 위해 조건부 된 미디어를 비침습적으로 수집할 수 있습니다. 모든 방법에서, 24h의 과정을 통해, 실험자는 세포 수가 허용하는 것처럼 수백 개의 오르가노이드 / 고환 구조를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 다른 크기와 형태와 구조로 조직 자체 조립을 촉진; 오르가노이드 크기는 다른 오르가노이드^{보고서(34)에서}볼 수 있듯이 배양에 사용되는 세포 수 및 농도에 따라 달라집니다. 오르가노이드 크기 나 직경을 줄이면 때로는 더 큰 오르가노이드에 있는 괴사의 내부 영역의 개발을 줄이는 데 도움이 될.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 um 매체 메마른 여과	Millipore 시그마	scgpu05re	메마른 거르는 매체를 위해
3β HSD 일차 항체	Cosmo Bio Co	K0607	Leydig 세포 마커, 1:500 희석
AlexaFluor 568 &-마우스	Thermo Fisher Scientific	A-21202	형광 태그 2차 항체
AlexaFluor 568 &-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	형광 태그 2차 항체
알파 최소 필수 매체	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	배양 매체의 기초
Collagenase I	Worthington Bio	LS004197	해리 용액 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234	2D 및 3D ECM 배양 젤 주조에 사용되는 세포 외 매트릭스
Countess Cell counter Thermo	Fisher Scientific	C10227	Autmated cell counter (혈구 측정기)
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드	Thermo Fisher Scientific	C10228	백작 자동 카운터와 함께 사용하기 위한 혈구계 슬라이드
DDX4 일차 항체	Abcam	138540	정자 마커, 1:500 희석
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	해리 용액 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	히알루로니다아제 재구성
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Collagenase I 및 Dnase I
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	소변 담금질 용액
Follicle 재구성용 자극 호르몬	Abcam	ab51888	장기 오가노이드 배양용
인간 융모성 성선 자극 호르몬	Millipore Sigma	C1063	장기 오가노이드 배양용
Hyaluronidase, 소 고환	Millipore Sigma	H4272	해리 용액 2
Inhibin B 효소 결합 면역흡착 분석	Ansh Labs	AL-107	Inhibin B ELISA 키트
KnockOut 세럼 교체용	Thermo Fisher Scientific	10828-028	용 혈청 소스
3D 페트리 접시 마이크로 몰드 스페로이드(24-35, 5x7 어레이)	Millipore Sigma	Z764051	3D ECM-Free 오가노이드 제조용
Nunc, Lab Tek II 챔버 슬라이드 시스템, 4-well	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	2D ECM-free 및 2D, 3D ECM 배양용
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	미디어용 항생제
Richard-Allan Scientific; Histogel, 검체 처리 젤	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	파라핀 매립 보조용
SOX9 일차 항체	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, 1:500 희석
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)	Teklad Global	2920	식물성 에스트로겐이 없는 마우스 식품
Tedklad Global Mouse Chow (유지 보수)	Teklad Global	2916	식물성 에스트로겐이 없는 쥐 음식
테스토스테론 효소 연결 면역흡착 분석	Calbiotech	TE373S	테스토스테론 ELISA 키트
Trypan 블루 솔루션, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	세포 계수
&알파;SMA 주요 항체	Millipore Sigma	A2547	주위 마커, 1:500 희석
&베타; 카테닌 1차 항체	BD Biosciences	610154	Sertoli 세포질 마커, 1:100 희석