고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

Summary

DNA 추출을 위한 96웰 플레이트를 적재하는 현재의 방법은 오염되기 쉽습니다. 우리는 우물 중 교차 오염의 위험을 감소 96 웰 플레이트를로드하기위한 새로운 방법을 자세히 설명합니다. 우리의 방법은 다른 연구자들이 고처리량 DNA 추출 기술의 효율성을 활용하고 오염 위험을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

Abstract

높은 처리량 DNA 염기서열 분석 기술은 미생물 지역 사회, 호스트 특성 및 광범위한 생태계 기능 간의 관계에 대한 이해의 발전에 실질적으로 기여했습니다. 이러한 급속한 폭과 시퀀싱 기능이 급격히 증가함에 따라 최대 효율로 환경 DNA를 추출, 증폭, 분석 및 해석하는 방법이 왔습니다. 불행히도, DNA 추출을 신속하게 수행하는 것은 샘플 중 오염 위험을 증가시켜야 할 수 있습니다. 특히, 96웰 플레이트에 포함된 샘플을 기반으로 하는 고처리량 추출은 단일 튜브 추출에 비해 비교적 빠른 방법을 제공하지만 잘 교차 오염을 위한 기회도 증가합니다. 시료 간 교차 오염 위험을 최소화하기 위해 고처리량 추출 기술의 이점을 유지하면서 환경 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 샘플을로드하는 동안 각 플레이트를 커버하기 위해 피어싱 식 PCR 밀봉 필름을 사용하고 우물로 이동하기 전에 PCR 튜브에 먼저 샘플을 추가했습니다. 이러한 관행은 함께 샘플 드리프트및 의도하지 않은 이중 유정 의 위험을 줄입니다. 이 논문에 설명된 방법은 연구원들에게 96웰 플레이트에 내재된 교차 오염 위험을 줄이면서 사용 가능한 고처리량 추출 기술을 극대화하는 방법을 제공합니다. 우리는 원치 않는 교차 오염의 위험을 최소화하면서 샘플 수집에서 DNA 추출로 이동하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다.

Introduction

미생물 공동체의 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 비교할 수 없는 시퀀싱 깊이를 제공하고 있으며, 결과적으로 지구의 미생물군유전체^1의기능과 다양성을 엿볼 수 있습니다. 단일 시퀀싱 레인에 점점 더 많은 샘플을 멀티플렉스하는 능력이 증가함에 따라 단일 튜브 DNA 추출은 생태 데이터 생성에서 속도 제한 단계가 될 가능성이 있습니다. 그러나, 고처리량 DNA 추출의 새로운 방법은 이전에 가능했던 것보다 더 큰 효율을 가진 다량의 환경 샘플을 처리하기위한 약속을^보유2. 이러한 방법은 종종 단일 튜브 대신 96 웰 플레이트를 사용하여 동시에 발생할 수있는 추출 수를 증가시키는 것을 포함합니다. 이와 같이, 고처리량 추출 방법의 실용성과 효율이 분명하고 토양^3,4 및 식물 조직^33,5에서 인간의 배설물^{물질 2에}이르기까지 환경 샘플의 처리를 위해 구현되었다.^,

이러한 방법은 시료 처리 및 DNA 추출을 따라 극적으로 속도를....

Protocol

1. 실험실 벤치 및 96 웰 플레이트를적재딩하기 위한 공구 준비

1. 70%에탄올로 미스티로 벤치 탑을 클리어합니다. 10% 표백제로 벤치 탑을 뿌리기 전에 공기를 닦고 건조시키십시오. 벤치 탑을 말리십시오.
2. 마이크로 스쿠뮬라, 주걱 및 외과 가위 (곡선)를 95 %에탄올에 담근 다음 화염에 노출하여 살균하십시오. 각 10%의 표백제에 담그고 사용하기 전에 공기 건조를 허용합니다.
   참고: 각 샘플 간에 도구를 소독해야 합니다.

2. 하위 샘플링 및 샘플 준비

1. 서브 샘플링 전에 에탄올을 사용하여 장갑을 살균하십시오.
2. 하위 샘플링 전에 토양 샘플을 균질화합니다.
3. 멸균 도구를 사용하여 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브를 샘플로 적재하여 약 절반까지 충전할 수 있습니다.
4. 모든 95개의 샘플이 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브로 하위 샘플링될 때까지 2.2를 반복합니다. 96^th 우물추출 공백으로 사용되어야 합니다.
   참고: 2.3 단계와 2.4단계는 필요한 저장 공간을 최소화하고 오버 또는 이중 샘플링을 방지하기 위해 수행됩니다.
5. 플레이트를 적재할 때까지 2mL 서브 샘플 튜브를 얼음....

Results

이 새로운 방법은 96웰 의 DNA 추출 플레이트를 로드하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 빈 우물에서 가장 낮은 DNA 농도를 갖는 우리의 방법을 보여 주었다. 빈 우물의 DNA 농도는 내 맥퍼슨 외⁹ (p< 0.05)를 제안한 방법보다 현저히 낮았지만, 우리의 방법의 DNA 농도는 Qiagen 기본 방법(도 2)과통계적으로 다르지 않았다. 생성된 세 가지 방법 모두 2 ng/μL 미만의 DNA 농도를 의미하지만, 우리의 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산했습니다.

그림 1: 단계별 방법으로 샘플을 DNA .......

Discussion

이 방법은 높은 처리량 샘플 추출 플레이트를 적재하는 동안 잘 교차 오염에 대한 기회를 줄이고 기존 플레이트 로딩 전략^9,,10을넘어 96 웰 플레이트를 로드하는 보다 제어된 수단을 제공한다. 우물 간의 오염은 단일 튜브 추출보다 96웰 의 플레이트 추출에 더 널리 퍼질 수 있으며, 특히^{자동화된 6,,7의}경우, 어떤 방법론에서도 구체적으로 테스트되지는 않지만, 판적 하중 기간 동안 추출 플레이트의 우물이 열려 있을 때 교차 오염의 위험이 가장 높은 것으로 가정될 수 있다. 단일 튜브 추출에 비해 플레이트 기반 추출에서 교차 오염의 기회가 증가하면 멸균 커버로 우물을 보호하는 것이 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 중요한 첫 번째 단계로 간주되어야 합니다. 이러한 필요성에도 불구하고, 높은 처리량 추출 키트에 제공된 지침은.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL 원심분리기 튜브	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L micro-PCR 튜브	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA 추출 키트	Qiagen	12955-4	우리는 토양 추출 키트를 사용했지만 모든 96-well 형식 키트가 작동합니다.
2 mL 원심분리기 튜브용 얼음 블록	2		mL 튜브용으로 만들어진 모든 얼음 블록은
200 µ를 위한 얼음 블록이 작동합니다; L 마이크로 PCR 튜브	모든	모든	얼음 블록은 200 µ를 위해 만들어졌습니다. L 튜브는 마이크로
스쿠큘라	모든
프리컷, 피어싱 가능한 씰링 필름,	엑셀, 과학	XPS25
주걱,	모든
수술 가위	모든