이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
소 마비 광견병 (BPR)은 라틴 아메리카 전역에 걸쳐 상당한 경제적 중요성의 바이러스 성 뇌염의 한 형태이며, 주요 동물 노 면 위험을 제기 합니다. 여기서, 우리의 목적은 정량적 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 이용하여 상이한 소 뇌 해부학 구조에서 광견병 바이러스(RABV) 게놈의 상대적 카피 수를 결정하는 실험실 프로토콜을 활용하는 것이었다. qRT-PCR은 시료에 존재하는 표적 핵산의 양에 직접적으로 비례하는 증폭 후 방출되는 형광에 기초하여 샘플에 존재하는 유전자 사본의 특정 수를 정량화한다. 이 방법은 짧은 기간, 오염 의 위험을 감소, 다른 기술에 비해 다른 샘플에서 바이러스 성 핵산을 검출 할 수있는 잠재력으로 인해 유리하다. 여섯 마리의 동물들의 뇌는 암몬의 뿔, 소뇌, 피질, 수질, 폰, 시상 등 여섯 가지 해부학적 구조로 나뉘었다. 모든 뇌는 직접적인 면역 형광 시험에 근거를 둔 RABV 항원에 대한 양성으로 확인되었습니다. 4개의 RABV 음성 소의 두뇌에서 동일 해부학 구조물도 평가되었습니다. RNA는 각 구조에서 추출되어 qRT-PCR에 사용되었습니다. 시험관 내 전사 뉴클레오단백질 유전자를 이용하여 RABV 유전자의 카피 수를 결정하기 위해 분석이 수행되었다. 바이러스 RNA를 정량화하는 데 사용되는 표준 곡선은 100% 및 0.99의 선형성을 나타냈다. 분석 결과, 피질, 수질 및 시상은 이러한 구조가 RABV의 최고 수준을 소유했다는 관측에 기초하여 RABV 검출에 사용하기에 이상적인 CNS 부분이었다는 것을 밝혔다. 시험 특이성은 100%였습니다. 모든 샘플은 긍정적이었고 거짓 긍정이 발견되지 않았습니다. 이 방법은 BPR의 진단 도중 RABV의 낮은 수준을 포함하는 견본에서 RABV를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.
서론
광견병은 뇌, 피부, 소변 또는 타액1에서바이러스 성 핵산의 검출을 가능하게 하는 다양한 기술에 의해 선행 및 사후 평가를 확인할 수 있다. 광견병 바이러스 뉴클레오단백질(N) 유전자의 검출은 주로 분자 시험에 의한 광견병 진단에 사용된다. 이 유전자는 또한 바이러스성 유전자 를 위해 이용됩니다. 광견병은 영향을받는 뇌의 어떤 부분을 사용하여 동물에서 진단 할 수 있습니다; 그러나 광견병의 가능성을 배제하려면 뇌의 적어도 두 부위에서 조직을 테스트해야합니다2. 동물에서 광견병 검출을 위한 몇몇 진단 방법은 존재합니다; 그러나, 직접적인 면역형광시험은 표준 기준기술3로남아 있다. 그밖 시험은 마우스 접종을 통합하는 생물학 시험을, 조직 배양에 있는 감염 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)4를포함합니다. 이러한 모든 기술은 인간과 동물의 광견병 진단을 위해 세계 보건 기구 (WHO)와 세계 동물 건강기구 (OIE)에 의해 각각 5권장됩니다.
핵산 검출 및 증폭 기술은 최근
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프로토콜
이 연구는 센트로 나시오날 드 Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 제공하는 동물의 사용에 대한 권고에 따라 엄격하게 승인되고 수행되었습니다.
1. 샘플
- RT-PCR 분석을 위해 6가지 광견병 양성 소 뇌에서 해부된 뇌의 다양한 영역을 사용하십시오.
2. 광견병을 확인하기 위한 직접 형광 항체(DFA)
참고: DFA에 의한 광견병 항원의 검출은 형광염 표지 항체를 사용하여 광견병 뉴클레오단백질의 존재를 결정하는 질적 방법입니다. 시험은 아래설명과 같이 Dean et al. (1966)20에서제공하는 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
- 직경 약 15mm의 멸균 슬라이드에서 다른 뇌 구조에서 해부된 각 조직에서 두 가지 인상을 남기십시오. 나무 어플리케이터를 사용하여 조직의 약3mm 3 부분을 멸균 슬라이드에 얼룩지게 합니다. 얼룩을 만들려면 나무 어플리케이터를 슬라이드에 수동으로 누릅니다.
- -20°C에서....
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결과
DFA 결과는 각각 피질, 시상, 수질, 폰 및 경적에서 RABV에 대해 100 %, 100 %, 83.3 %, 66 %, 50 %의 긍정성을 보였다. 이러한 결과는 이전 결과를 확인, 각 뇌에서 해부 구조의 적어도 세 RABV에 대 한 긍정적인. 대표적인 양성 DAF 염색은 도 1에표시됩니다.
도 2는 로자-루비오 외11에의해 보고된 프라이머를 처음 보고한 프라이머와 함께 RABV N 유전자(Step 5.5)의 단편의 증폭을 나타낸다. 이는 증폭에 사용되는 물질이 양호한 것으로 나타났다.
PCR 증폭 된 조각의 크기는 도 3에표시됩니다. 표준 곡선의 방정식은 샘플에서 RABV 유전 함량의 양과 PCR 증폭 단편의 크기 사이의 관.......
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토론
이전 연구는 DFA가 실온 (21 °C)14에서저장되는 샘플의 7 일 이내에 RABV를 감지 할 수 있음을 보여 주었다. 대조적으로, 이 연구는 견본이 12 일 동안 실온에 드러낸 후에 RT-PCR의 감도가 감소하기 시작한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 RABV 게놈은 최대 23일 동안 실온에 노출된 샘플에서 qRT-PCR에 의해 검출될 수 있다. 이는 qRT-PCR의 감도가 더 높게 분해된 시료에 대해 상대적으로 높다는 것을 보여줍니다. 그러나특이성(25)을손상시키지 않는 간단한 방법을 개발할 필요가 있다. 본 연구는 특정 뇌 구조에 관계없이 바이러스 게놈을 검출할 수 있었다는 관측에 기초하여 DFA보다 더 높은 감도를 지닌 분자 분석체를 시연했다.
전염성 에이전트 검출에 있는 사용을 위한 RT-PCR 기술의 이점은 몇몇 과학적인 연구 결과에서 강조되었습니다. 그러나 이 기술은 특수 장비가 .......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 농업, 임업 및 가축 연구 (INIFAP)에 의해 지원되었다. 이 문서와 관련된 비디오 개발에 대한 그의 협력에 대한 Jerzayn Fraustro Esquivel에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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참고문헌
- Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
- CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies.
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재인쇄 및 허가
