이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.
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시냅스는 뉴런의 기능적 요소이며 결함이나 손실은 여러 신경 퇴행성 및 신경 장애의 기초입니다. 이미징 연구는 생리학적 및 병리학 적 조건에서 자신의 기능과 가소성을 조사하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 크기와 구조 때문에 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 구조화 된 조명 현미경 검사 (SIM)를 사용하여 초해상도 수준에서 시냅스 마커와 대상 단백질의 공동 국소화를 1 차 뉴런에서 연구하는 절차를 설명합니다. SIM은 광야 현미경 검사법의 공간 해상도를 두 배로 늘려 약 100nm의 세부 사항에 도달하는 패턴 조명 기술입니다. 이 프로토콜은 강력한 공동 지역화 연구에 필요한 제어 및 설정과 이미징 데이터를 제대로 분석하는 통계 방법에 대한 개요를 나타냅니다.
시냅스의 이해와 견해는 1897년 포스터와 셔링턴의 첫 번째 설명 이후1엄청나게 변했다. 그 이후로, 신경 통신및 그 뒤에 분자 프로세스에 대한 우리의 지식은 기하 급수적으로 성장했다2. 시냅스는 신경 전달 물질의 방출을위한 소포를 포함하는 사전 시냅스 구획과수용체3를가진 시냅스 후 구획으로 생각할 수 있다는 것이 분명해졌습니다. 이 단순한 보기는, 지난 20 년 에서, 신호4로송신기 결합을 변환하는 데 필요한 단백질의 복잡한 네트워크로 진화했다.
이해의 이득은 부분적으로 시냅스의 치수에 맞게 종래의 광 현미경 검사법의 회절 한계를 극복슈퍼 해상도 기술로 인해5,,6,,7,,8,,9,,10. 회절 제한으로 인해 광학 현미경은....
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1. 1차 문화
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우리는 여기에 신경 단백질 을 공동 국소화를 연구하는 표준 워크 플로우를 제시합니다. 우리는 먼저 현미경을 보정하고 다음 우리는 샘플의 SIM 분석을 수행했다. 시스템을 보정하기 위해 직경 0.1 μm의 형광 마이크로스피어를 사용했습니다. 구슬의 매우 해결된 3D-SIM 이미지를 얻으면 기본 이미지 데이터는 포리에 변환되어 공간 주파수 표현으로 다시 변환됩니다. 도 2A에서뚜렷한 꽃 패턴은 초해상도 세부 레벨의 표시로 제시된다. 다음으로 단일 비드의 강도프로파일(그림 2B,C)의피크의 전체 폭을 절반 최대(FWHM)로 계산하여 달성된 해상도를 측정했습니다. 마지막으로, 채널 등록에 의해 색수차를 수정하여 형광 마이크로스피어(그림3A, B)를다시 사용했습니다. 다음으로 100배의 목표로 샘플을 분석하기 시작했고 .......
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시냅스의 구조와 구성을 해명하는 것은 기억과 인식을 조절하는 생리학적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 정상 상태에서 시냅스는 기억의 구성 요소이며, 알츠하이머병(32)과같은 복잡한 신경 장애의 기초이기도 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 SIM에게 불린 초해상도 현미경 기술으로 신경 단백질의 공동 현지화를 공부하는 역할을 합니다. SIM은 특정 조명 패턴을 사용하여 약 0.1 μm의 해상도에 도달할 수 있으며, 이는 일반적으로 0.03에서 0.15 μm 사이를 측정하는 시냅스의 연구에 적합합니다. 더욱 자세히 설명하면, 10-20 nm의 해상도에 도달 할 수있는 STED (자극 방출 고갈 미세 검사법), PALM (사진 활성화 국소화 현미경 검사법) 또는 STORM (스토세스 틱 광 재건 현미경 검사법과 같은 다른 초해상도 기술은33)를적용 할 수 있습니다.
여기서는 1차 뉴런.......
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저자는 공개 할 것이 없습니다.
저자는 원고의 건설적인 비판에 대한 도아르도 미코티에게 감사드립니다. 이 연구는 브라이트 포커스 A2019296F에 의해 지원되었다, 폰도 디 베네피첸자에 의해 - 그루프포 인테사 산파올로 (LC), 라 라이스사 바이오 메디카 당 폰다지오네 지역 (Care4NeuroRare CP_20 / 2018) (CN) 마리 Skłodowska-Curie 혁신적인 교육 네트워크 (JK)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 트리판 블루 솔루션 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 &마이크로; M 필터 | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | 항체 |
| 항체 SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | 항체 |
| B27 보충제 | Life Technologies | 17504044 | |
| Chemical Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | 화학 |
| 챔버 커버슬립 | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | 항체 |
| FBS(Hyclone) | GIBCO | SH3007002(CHA1111L) | 혈청 |
| FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어, 0.1 μ M, 옐로우– 녹색 형광 | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| 포도당 | Merck Life Science | G8769 | 화학 |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 화학 | |
| HEPES | Merck 생명 과학 | H3537 | 화학 |
| L-Cystein | 머크 생명과학 | C6852-25g | 화학 |
| MAP2 | Merck | AB15452 | 항체 |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | 화학 |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | 화학 |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM 초고해상도 현미경 | Nikon-Instrument | ||
| Papain | Merck Life Science& 주의; | P-3125 | 화학 |
| 파라포름알데히드 | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 화학 |
| 펜/스트렙 10x | 생명 과학 | 15140122 | 화학 |
| 인산염 완충 식염수 | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong 다이아몬드 유리 안티페이드 마운턴트 | Thermo Fisher Scientific | P36970 | 화학 |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | 항체 |
| 라운드 커버글라스 | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | 항체 |
| Synaptophysin | 머크 | S5768 | 항체 |
| 트리톤 X-100 | Merck | T8787 | 화학 |
| 트립신 억제제 | 머크 생명과학 | T9003-500MG | 화학 |
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