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방법 논문

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

5K 조회수

DOI:

10.3791/61439

2020년 5월 11일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.

초록

생체 내에서 척추 운동신경의 세포내 기록은 그대로 척추 네트워크에서 세포의 전기 생리적 특성을 결정하기위한 "금 본위제"를 제공하고 고전적인 체외 또는 세포 외 기록 기술에 비해 상당한 장점을 보유하고 있습니다. 생체 내 세포 내 기록의 장점은 이 방법이 완전히 성숙한 신경계를 가진 성인 동물에서 수행될 수 있고, 따라서 많은 관찰된 생리적 기계장치가 실제 적인 응용 프로그램으로 번역될 수 있다는 것입니다. 이 방법론 논문에서, 우리는 척추 신경 네트워크 내에서 발생하는 편광 과정을 모방 외부적으로 적용 된 일정한 전류 자극과 결합된이 절차를 설명합니다. 트랜스 척추 직접 전류 자극 (tsDCS)은 스포츠뿐만 아니라 다양한 신경 손상 후 재활에 신경 조절 개입으로 점점 더 많이 사용되는 혁신적인 방법입니다. 신경계에 tsDCS의 영향은 제대로 이해 되지 남아 있으며 그것의 행동 뒤에 생리 적 메커니즘은 크게 알 수 없습니다. tsDCS를 세포내 기록과 동시에 적용하면 tsDCS 동작에 대한 이해가 중요한 척추 뉴런 네트워크의 편광에 대응하여 모토뉴런 막 특성및 리듬 발사특성의 변화를 직접 관찰할 수 있습니다. 더욱이, 제시된 프로토콜이 내측 근육 및 그 기능(굴곡 대 엑스텐서)과 생리적 유형(fast vs slow)에 대하여 모토뉴런의 식별을 포함할 때, 이는 편광에 의해 다르게 영향을 받는 척수 회로의 식별된 구성 요소에 대한 tsDCS의 영향을 선택적으로 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 제시된 절차는 결과의 준비 안정성 및 재현성을 달성하는 데 필요한 단계에 중점을 두고 세포 내 기록 및 자극을 위한 외과 준비에 중점을 둡니다. 무음 또는 음극 tsDCS 응용 프로그램의 방법론의 세부 사항은 실용적이고 안전 문제에주의를 기울이면서 논의됩니다.

서론

트랜스-척추 직접 전류 자극(tsDCS)은 건강과,질병1,2,23에서척추 회로 흥분성을 수정하는 강력한 방법으로 인정을 받고 있다. 이 기법에서, 일정한 전류는 선택된 척추 세그먼트 위에 위치한 활성 전극 사이에 전달되며, 기준 전극은 통풍구 또는 더 rostrally4에위치한다. 여러 연구는 이미 tsDCS가 신경병증 통증5,경련6,척수 손상7 또는 재활을 용이하게하기 위해 특정 병리학 적 상태를 관리하는 데 사용될 수 있음을 확인했다8. 연구원은 tsDCS가 세포막을 가로 질러 세포내 및 세포 외 공간 사이 이온 분포에 있는 변경을 불러 일으킨다는 것을 건의하고, 이것은 현재방향에따라서 신경 활동을 촉진하거나 억제할 수 있습니다9,10,,11. 그....

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프로토콜

이 프로토콜과 관련된 모든 절차는 해당 당국(예: 지역 윤리위원회)에 의해 받아들여졌으며 동물 복지 및 관리에 관한 국내 및 국제 규칙을 따릅니다.

참고: 절차에 관여하는 각 참가자는 기본적인 외과 적 수술에 적절하게 훈련되어야하며 동물 실험을 수행하기위한 유효한 라이센스를 가져야합니다.

1. 마취 및 사전 약물

  1. 나트륨 pentobarbital의 관면 주사로 쥐를 마취시킵니다 (400\u2012550g의 무게6 개월 된 남성 위스타 쥐에 대한 60 mg, kg-1의 초기 용량).
    참고 : 이 프로토콜은 표시된 변형, 성별 또는 쥐의 나이에 국한되지 않습니다. 또한 케타민 자일라진 믹스, 알파 클로랄로오스 또는 펜타닐+미다졸람+메데토미딘과 같은 대체 마취는 다른 연구 목표에 더 적합하거나 윤리위원회에서 요구하는 경우 사용될 수 있다.
  2. 약 5분 후, 쥐의 뒷팔두다리 발가락을 무딘 집게로 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 반사 작용이 관찰되지 않은 경우에만 프로토콜의 다음 단계를 진행합니다.
  3. 삽관 후 점액 생산을 줄이기 위해 0.05 mL의 아트로핀을 피하하십시오.
  4. 4% 포도당 용액을 함유한 인산염 완....

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결과

세포 침투의 안정적인 조건이 보장될 때 작업 잠재력 및 여러 멤브레인 특성의 매개 변수는 세포 내 기록에 기초하여 계산될 수 있다. 도 1A는 세포 내 자극에 의해 발생되는 전형적인 직교 작용 잠재력을 제시하며, 이는 데이터 포함에 대한 모든 기준을 충족합니다(적어도 -50 mV의 휴식 막 전위, 및 50mV 이상의 스파이크 진폭은 양성 오버슈트로). 스파이크 진폭, 후극극 진폭 또는 과극 후 반부패 시간(AHP-HDT)과 같은 작용 전위 파라미터를 측정할 수 있다. 쥐 모토뉴런의 후자 파라미터의 값은 빠르고 느린 모토뉴런(AHP-HDT > 20ms 저속, 빠른 motoneurons용 AHP-HDT <20 ms)을 구별하기 위한 신뢰할 수 있는 기준 역할을한다. 도 1B는 1nA의 100ms 과극전류 펄스에 대한 세포 반응을 나타내며, 이로부터 모토뉴런의 피크 및 고원 .......

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토론

올바르게 수행되는 경우, 설명된 프로토콜의 수술 부분은 약 3시간 이내에 완료되어야 한다. 하나는 수술 중 동물의 안정적인 생리 적 상태를 유지에 특히주의해야한다, 특히 체온과 마취의 깊이. 명백한 윤리적 고려 사항 외에도 적절한 마취가 부족하면 신경 해부 또는 라미네절제술 중 과도한 사지 운동이 발생할 수 있으며 준비 또는 조기 실험 종료에 손상을 초래할 수 있습니다. 척수를 미세 전극으로 관통하기 전에 동물을 마비시면 마취와 심박수의 깊이를 모니터링하고 동물의 체중과 폐 용량에 따라 적절한 환기 매개 변수를 적용하는 것이 중요합니다. 원하는 생리 학적 매개 변수에서 임의의 편차는 절차 성공을 보장하기 위해 즉시 수정해야합니다. 수술 후, 안정적인 기록 조건은 적어도 4 시간 동안 유지 해야합니다.

모토뉴런의 침투 후, 레코딩 안정성이 매우 중요합니다. 어떤 변동도 류베이스 전류와 리듬 발사의 임계값에 크게 영향을 미치기 때문에 멤브레인 잠재력은 제어 기록 중에 일정하게 유지되.......

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공개 사항

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 국립 과학 센터 보조금 번호에 의해 지원되었다 2017/25/ B / NZ7/00373. 저자는 한나 Drzymała-Celichowska와 Włodzimierz Mrówczyinski의 작품을 인식하고 싶습니다, 둘 다 이 논문에 제시된 결과의 데이터 수집 및 분석에 기여했습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Durgs 및 솔루션--
Atropinum sulfuricumPolfa Warszawa--
GlucoseMerck346351-NaHCO3
Merck
106329-Pancuronium JelfaPharmaSwiss/Valeant-Neuromuscularblocker
Pentobarbital sodiumBiowet Pu?awy Sp. zo.o-Main마취제
Pottasium citrateChempur6100-05-06-Tetraspan
Braun-HESsolution
Surgical equipment--
-21 BladeFST10021-00메스 블레이드
소작자FST18010-00-
흉관MilaCT1215-Dumont
#4 집게FST11241-30근육 집게
Dumont #5 집게FST11254-20듀라 집게
Dumont #5F 집게FST11255-20신경 집게
Dumont #5SF 집게FST11252-00Pia 집게
집게FST11008-13무딘 집게
집게FST11053-10피부 집게
지혈FST13013-14-Rongeur
FST16021-14laminectomy
가위FST15000-08정맥 가
FST15002-08Dura 가위
가위FST14184-09기관 절단
가위FST104075-11근육 가위
FST14002-13피부 가위
기관 튜브-맞춤형
정맥 카테터Vygon1261.201-
혈관 캐뉼레이션 겸자FST18403-11-
혈관 클램프FST18320-11정맥 클램핑
용 혈관 확장 프로브FST10160-13정맥 박리
Sugrgical 재료 < / strong>--
-젤 폼PfizerGTIN 00300090315085지혈제
실크 봉합사 4.0FST18020-40-
실크 봉합사 6.0FST18020-60-
Equipment--
-Axoclamp 2B분자 장치단종내 증폭기/새 모델 Axoclamp 900A
CapStar-100 호기말 CO2 모니터CWE11-10000가스 분석기
Grass S-88A-M 시스템단종정전류 자극기
유연한 프로브가 있는 동종 담요 시스템Harvard Apparatus507222F난방 시스템
ISO-DAM8AWPI74020세포 외 증폭기
마이크로드라이브--맞춤형 제작/교체 IVM/Scientifica
P-1000 미세 전극 풀러Sutter InstrumentsP-1000마이크로 전극 풀러
SAR-830/AP 소형 동물 인공호흡기CWE12-02100호흡기
지원 프레임--맞춤 제작/교체 실험실 표준 베이스 51601/Stoelting
척추 클램프--맞춤 제작/교체 쥐 척추 어댑터 51695/Stoelting
TP-1 DC 자극기WiNUE-tsDCS 자극기
<강한>기타-
-1B150-4 유리 모세관WPI1B150-4미세 전극 생산용
면모--
유연한 튜브--인공 호흡기 및 CO2 분석기 연결용
MicroFilWPIMF28G67-5마이크로피펫 충전용
Silver wire--신경 전극용
가 세포

참고문헌

  1. Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).
  2. Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A.

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