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방법 논문

하이드로겔 생체 재료 비계의 주입 뇌졸중 후 뇌에

5.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61450

⸱

2020년 10월 1일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

이 논문에서

요약

뇌졸중은 최소한의 치료 옵션과 잃어버린 뇌 조직을 재생하기위한 현재 임상 치료와 글로벌 문제입니다. 여기에서 우리는 설치류의 모터 피질에 정확한 광혈전 뇌졸중을 만들고 뇌졸중 후 조직 재생에 미치는 영향을 연구하기 위해 하이드로 겔 생체 재료의 후속 주입을 만드는 방법을 설명합니다.

초록

뇌졸중은 장애의 주요 원인과 미국에서 다섯 번째 주요 사망 원인입니다. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성 뇌졸중이며 뇌에 혈액을 공급하는 혈관의 갑작스런 막힘으로 정의됩니다. 막힘의 분 안에, 세포는 정지하기 시작하고 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래합니다. 현재 치료 치료는 혈전 제거 또는 용해에 초점을 맞추어 재관류를 허용하고 더 심각한 뇌 손상을 예방합니다. 일시적인 뇌 가소성은 시간이 지남에 따라 손상된 조직의 일부를 구출 할 수 있지만, 환자의 상당한 분수는 결코 해결되지 않을 신경 적자로 남아 있습니다. 뇌졸중으로 인한 신경 학적 적자를 치료하는 치료 옵션의 부족이있다, 이 증가하는 환자 인구를 치료하는 새로운 전략을 개발하는 필요성을 강조. 주사용 생체 재료는 현재 뇌 가소성을 향상시키고 활성 제또는 줄기 세포의 전달을 통해 내인성 수리를 개선하도록 설계되고 있습니다. 이러한 접근법을 테스트하는 한 가지 방법은 설치류 스트로크 모델을 활용하고, 생체 물질을 스트로크 코어에 주입하고, 수리를 평가하는 것입니다. 뇌졸중 코어의 정확한 위치를 아는 것은 뇌졸중 후 정확한 치료에 필수적이므로 예측 가능한 뇌졸중 위치를 초래하는 뇌졸중 모델은 주입 전에 이미징의 필요성을 피하는 것이 바람직하다. 다음 프로토콜은 광혈전 뇌졸중을 유도하는 방법, 제어되고 정확한 방식으로 하이드로겔을 주입하는 방법, 생물 물질을 손상시키면서 뇌를 추출하고 저온절하는 방법을 다룰 것입니다. 또한, 이러한 동일한 하이드로겔 물질이 줄기 세포의 공동 전달에 어떻게 사용될 수 있는지 강조할 것입니다. 이 프로토콜은 뇌졸중 코어내로 다른 주사용 생체 물질을 사용하는 것으로 일반화될 수 있다.

서론

뇌졸중은 장애의 주요 원인이며 미국에서 다섯 번째로 주요 사망원인입니다 1. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성이며 나머지 13%의 대다수는 출혈2입니다. 허혈성 뇌졸중은 주변 조직에 동맥에서 혈류의 막힘으로 정의됩니다. 이 폐색은 수시로 살아남는 환자에 있는 영원한 무력으로 이끌어 내는 산소 부족 그리고 후속 괴사 귀착됩니다. 뇌졸중3의사망률이 감소했지만, 2030년까지 보급은340만명으로 증가할 것으로 예상된다. 장애인 생존자의 증가와 그에 따른 경제적 부담은 신경 수리 메커니즘에 초점을 맞춘 뇌졸중 연구를 위한 추진으로 이어졌습니다. 뇌졸중 다음에 는 괴사 영역이 팽창하는 것을 방지하는 흉터의 형성으로 이어지는 염증 성 기간이 있습니다. 괴사 코어를 둘러싼 지역은 "peri-farct"라고 하며 혈관 신생, 신경 발생 및 축산 발아증가를 포함하는 이 지역의 가소성이 동물 모델과 인간5에서관찰된 회복에 직접 연결된다는 강력한 증거가 있다. 뇌졸중 후 복잡한 상호 작용을 적절하게 복제 할 수있는 체외 모델이 없기 때문에 동물 모델은 뇌졸중 연구에 필수적입니다.

허혈성 스트로크를 생성하는 데 사용할 수있는 생체 내 모델이 몇 가지 있습니다. 마우스에 사용되는 가장 일반적인 모델 중 하나는 말단 또는 근위 (동맥 내 필라멘트를 통해) 폐색을 통해 중간 뇌동맥 폐색, 또는 MCAo입니다. 필라멘트 MCAo (fMCAo)라고도 하는 근위 모델은 일반적으로 대뇌 반구의 5 %에서 50 %까지 포괄하는 큰 허혈성 뇌졸중을 초래하며 요인6의수에 의존합니다. 이러한 모델에서 봉합사 또는 필라멘트는 내부 경동맥에서 중간 뇌동맥(MCA)의 기저부로 발전하여 특정 기간 동안 제자리에 보관된다. 임시 또는 영구로 만들 수 있는 폐색을 위한 이 방법은, 줄무늬에 중심이 되는 광원을 생성하고, 피질6을지나치게 관련시킬 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다. 결과 뇌졸중 크기는 매우 가변적이며 레이저 도플러와 같은 이미징 기술은 각 마우스에서 절차의 효과를 확인하는 데 필요합니다. 30분 이상 지속되는 동맥 내 또는 발내 필라멘트 폐색은 크기 범위의 더 큰 끝에서 스트로크를 생성합니다. 일부 조사관은 상당한 실험 초점과 실험실 검증7을필요로하는 짧은 필라멘트 폐색 시간에 초점을 맞추고있다. 마우스에 있는 필라멘트 MCAo 모형은 인간 적인 치기 케이스에서 보인 것과 같이 세포 죽음, 허혈성 진행 및 peri-farct 영역의 형성의 유사한 단계를 따릅니다; 그러나, 더 큰 치기는 악성 뇌 경색의 질병 상태를 더 가깝게 닮은, 덜 일반적이다, 덜 치료 인간 뇌졸중6. 한편, 말단 MCA 폐색은 더 관련된 수술및 craniectomy를 요구합니다. 이 모델에서, 뇌의 표면을 따라 실행되는 MCA의 말단 부분은 봉합사 넥타이 또는 소작으로 직접 가려져 있습니다. 기술의 일부 변형에서, 경동맥은 일방적또는 일시적으로 양측으로 가려져 있다. 말단 MCAo의 장점은 필라멘트 모델보다 크기가 덜 가변적인 피질 기반 스트로크를 생성한다는 것입니다. 그러나, 해단 모델은 fMCAo6의관심사인 외부 경동맥(ECA)의 질부로 인해 더 열악한 행동 출력을 생성한다.

덜 침습적 인 것으로 알려진 대체 뇌졸중 모델은 광혈전증 (PT) 모델입니다. PT 모델은 허혈의 잘 정의된 위치를 초래하고 높은 생존율8과연관된다. 이 기술은 빛 또는 레이저9로원하는 조직을 조사하기만 하면 인트라바스내 광 산화를 허용하는 인트라바스트(intraitone)에 주입된 감광성 염료에 의존한다. 자궁내막시, 내피 손상을 유발하는 산소 라디칼이 형성되어 조사부위8,9에서혈소판 응집 및 응고 형성을 활성화한다. 뇌졸중 크기와 위치를 엄격하게 제어할 뿐만 아니라 PT 모델의 높은 재현성은 생체 재료 연구에 이상적입니다. 정밀도는 레이저 및 스테레오탁스 좌표를 사용하여 가능하지만, 이 모델이 몇 가지 연구에 적합하지 않을 수 있다는 몇 가지 단점이 있습니다. fMCAo 모델과 달리 PT 스트로크 모델은 레퍼퍼프할 수 없습니다. 따라서, 재퍼퓨전 또는 레퍼퓨전 다음 메커니즘에 따른 손상에 특정한 신경보호제 조사를 위한 물질은 여기에서 유용하지 않을 것이다8. 또한 PT 모델의 미세 혈관 모욕으로 인해 상대적으로 작은 허혈성 음벌브라가 보입니다. 대신, 국소 혈관부종은 인간 뇌졸중에 특이하지 않은 것으로 발생하며, 이 모델은 peri-farct 영역6,8에초점을 맞춘 전임상 약물 연구에 바람직하지 않다.

뇌졸중의 생물 물질 전략의 전반적인 목표는 생리 활성 에이전트를 제공하거나 뇌 조직 성장을위한 대리 세포 외 매트릭스 역할을하는 것입니다. 우리가 우리의 방법을 사용하여 탐구할 한 가지 전략은 많은 현재 세포 치료가10전달되는peri-infarct 조직과 는 반대로, 스트로크 코어로 직접 하이드로겔을 전달하는 것입니다. 이 접근법에 대한 근거는 코어에서 발견되는 괴사 조직으로의 전달이 주변의 건강하거나 회복 조직을 방해하지 않을 것이라는 것입니다. 우리는 생물 물질 에 포함 된 임의의 활성 제의 확산은 코어에서 peri-farct에 도달 할 수있을 것입니다 가정, 우리는 하이드로 겔 생체 재료의 전달이 신경교 흉터(11)의두께를 감소 발견하기 때문에 특히. 이것은 peri-farct 지역이 치기 후에 신경 가소성을 전시하기 위하여 표시되었기 때문에 중요합니다, 매력적인 표적으로 만드는. 더욱이, 뇌졸중 코어에 대리 매트릭스의 전달은 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 혈관신생12 또는신경유발성 13인자를 로드할 수 있으며, 전달을 위한 세포(14). 세포 전달은 전달 중에 존재하는 가혹한 주입력 및 현지 환경으로부터 세포를 보호하고 분화 및이식(15)을장려하기 때문에 매트릭스를 사용하여 크게 향상된다.

이러한 주 사용 치료 생체 재료는 뇌졸중 응용 프로그램에서 임상 관련성이 있다, 현재 뇌졸중 후 신경 복구를 자극 하는 의료 치료. 복구에 관여하는 근본적인 신경 회로는 뇌졸중 코어16에인접한 뇌 조직에 있으며 뇌졸중 코어 자체는 실행 가능한 신경 조직이 없습니다. 괴사 뇌졸중 코어에 생체 물질을 전달하는 것은 이전에 언급 된 여러 메커니즘을 통해 인접 조직을 재생 프로세스로 자극 할 수있는 잠재력을 가지고 있을 것으로 예상됩니다( 성장 인자13의창고 방출, 조직 성장 의 자극 및 뇌 조직 개발의 촉진11,12,면역 반응의 변경 17, 줄기 세포 유래 치료제의 전달14, 18. 그러나 이러한 응용 프로그램의 가능성을 효과적으로 연구하기 위해서는 뇌졸중을 유도하고 생체 재료를 주입하는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. PT 스트로크 모델은 스트로크의 방향과 위치를 정밀하게 제어하는 기술을 사용합니다. 스테레오탁틱 장치에 부착된 레이저는 방향을 안내하고, 스테레오택시 장치에 부착된 펌프는 추가 형태의 이미징 없이 재료의 사출 속도를 제어합니다. 따라서, 우리는 마우스의 모터 피질에서 PT 뇌졸중을 수행하고 뇌졸중 코어에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명하기로 결정했습니다. 여기서, 우리는 추가된 세포 또는 성장 인자가 없는 주입을 위한 생물재료로 미세다공성 안구 입자(MAP) 하이드로겔을 사용합니다. 또한, 우리는 성공적으로 그대로 생물 재료로 뇌를 검색하는 방법을 설명하고, 우리는 생체 재료의 주입없이 뇌졸중 결과를 분석하는 데 사용되는 면역 화학 분석에 대해 논의.

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프로토콜

실험은 듀크 대학과 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학의 IUCAC에 따라 수행되었다. 8 에서 12 주 된 남성 C57Bl/6J 마우스는이 연구에서 사용 되었다. 동물은 12h 빛-어두운 주기 기간과 펠릿 식품 및 물 광고 리비툼에 접근할 수 있는 제어 온도(22± 2°C)하에 보관되었습니다. 진통제 및 식기 프로토콜은 IUCAC에 의해 승인된 것으로 설명되지만 다른 실험실에서 사용되는 프로토콜과 다를 수 있습니다.

동물은 과도한 불안, 발성 (통제 할 수없는 통증을 나타내는), 자기 외상, 감소 또는 손상 된 이동성, 진피 감염의 물리적 징후, 식욕 의 손실 및 / 또는 체중 감소가 생존 수술의 결과로 10%-15 % 이상인 경우 조기에 안락사 될 수 있습니다. 젤의 주입에서 예상 되는 부작용이 있다, 그것은 뇌 내에서 자연 발생 중합체로 구성. 동물은 주말과 공휴일을 포함하여 매일 모니터링되어야하며 격일로 재계해야합니다. 우리의 실험실 및 다른 사람에서 연구 ' 그루밍에 적자를 발견, 체중의 손실 또는 이 작은 피 질 또는 피코르탈 뇌졸중 후 쥐에 금 단 또는 만성 스트레스의 징후/증상. 동물이 현지 머리 상처 감염의 징후를 나타내는 경우 안락사해야합니다. 동물은 또한 가난한 그루밍, 상처 상태 및 동물 (허리 상처) 사이의 싸움의 증거에 대한 모니터링해야합니다. 싸움이나 상처 의 증거가있는 경우, 동물은 먼저 수의사에게 연락 한 후 치료해야합니다. 이것은 수시로 물 및/또는 현지 국소 항생제 응용에 있는 항생제를 관련시킵니다. 이러한 조치가 치유를 생성하지 못하면 동물은 안락사되어야합니다.

1. 재료 및 계측기 준비

  1. 수술 전에 광혈증 염료를 준비하십시오. 2 mL 마이크로 센심 분리튜브에 로즈 벵골의 15 mg을 무게.
    주의: 로즈 벵골심각한 눈 손상/자극을 일으킬 수 있습니다.
    1. 10 mg/mL의 작동 농도를 만들기 위해 멸균 여과 1x PBS의 1.5 mL에 로즈 벵골을 녹입니다.
    2. 덩어리가 보이지 않게 될 때까지 튜브를 소용돌이치며, 염료가 완전히 용해되었음을 나타내는 다음 추가 사용이 끝날 때까지 호일로 덮습니다.
      참고: 필요한 염료의 양은 마우스 수에 따라 달라집니다. 염료는 20g 마우스용 10 μL/g, 예를 들어 200 μL의 농도로 인계 IP를 주입한다.
  2. 마취(37°C) 동안 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 켭니다.
  3. 자동 가위, 집게, 면, 수의사 눈 연고, 수술 접착제 또는 봉합사 재료, 파란색 또는 검은 색 수술 마커 및 멸균 알코올 및 베타 요오드 물티슈를 준비하십시오. 멸균 드릴 비트 헤드로 뼈 드릴을 준비합니다.
  4. 마우스 수술 사이의 기기의 살균을 허용하기 위해 비드 살균을 160°C로 켭니다. 나중에 수화 작동 영역을 유지하는 데 사용할 수 있는 멸균 식염수 식염수 또는 1x PBS 용액의 50mL 원추형 튜브를 따로 둡니다.
  5. 스테레오탁스 장치에 레이저를 부착합니다. 레이저 안전 고글을 착용, 레이저 (mW)의 힘을 측정합니다.
    주의: 레이저가 시술에서 켜될 때마다 레이저 안전 고글을 사용합니다.
    1. 레이저 출력이 10mW를 읽을 때까지 레이저 제조 지침에 따라 레이저 콘솔의 전류를 조정하고 홈 스크린 콘솔에서 전류를 미리 설정으로 설정합니다. 그런 다음 전류를 다시 조정하여 레이저 출력 출력 출력이 40mW를 읽는 또 다른 사전 설정을 설정합니다. 이제 추가 사용이 될 때까지 레이저를 끕니다.
      참고: 10mW는 사용하기 전에 레이저를 방향을 지정하는 데 사용됩니다.
  6. 수술 후 마우스를 위한 깨끗한 케이지를 준비합니다. 그런 다음 마우스를 4%의 이소플루란 농도로 유도챔버에 배치하여 자발적인 움직임이 멈추고 호흡이 느리고 꾸준한 속도로 나올 때까지 마취합니다.
  7. 일단 잠들면 마우스의 무게를 측정하여 주입할 로즈 벵골 염료를 결정합니다. 이어서, 1.5%의 유지보수 이소플루란 농도로 입체장치로 마우스를 이송 및 고정한다.
    참고: 이소플루란 농도가 증가하면 혈관을 팽창시키고 마우스 사이에 충분한 폐색 또는 일관되게 크기의 뇌졸중을 방지할 수 있습니다.
  8. 두 눈에 수의사 눈 연고를 적용합니다.
    참고: 절차 전반에 걸쳐 호흡과 온도를 관찰하고 가끔 발가락을 꼬집어 마우스가 아무 것도 느끼지 못하도록 합니다.

2. 광혈증 뇌졸중 모델9

  1. 마우스의 머리에서 털을 면도하고 베타 요오드 와이프 다음 알코올 닦아하여 무균영역을 준비합니다. 세 번 반복합니다.
    참고: 필요한 경우, 수술 후 두개골을 가려워쥐는 피부 자극을 유발하는 모든 베타 요오드를 청소하기 위해 마지막에 여분의 알코올 닦이를 사용하십시오.
  2. 작은 수술 가위를 사용하여, 약 1-2cm, 눈에 귀 사이의 측면 절개를합니다. 이 작업을 수행하여 포셉으로 피부를 위쪽으로 당겨 텐트를 만들고, 한 번 아래쪽으로 절단한 다음 가위를 개구부에 삽입하고 연속적인 중간 선 절개를 만들어 보세요.
  3. 피부를 분리하고 정수리 뼈를 집게로 가볍게 눌러 bregma를 찾습니다. 수술 마커를 사용하여 점으로 브레그마를 표시합니다.
    참고: 뼈 조각 운동은 정수리 뼈의 정면 경계를 강조합니다. bregma는 정면 및 정수리 뼈 조각이 만나는 중심점입니다(그림 1A).
  4. 레이저 안전 고글을 착용하고, 마우스의 두개골 위에 레이저를 이동하여 90° 각도로 스테레오탁스 장치를 고정시하십시오. 10mW 사전 설정을 선택하고 레이저를 켭니다.
    1. 레이저의 x 축과 y축이 브레그마 바로 위에 도달할 때까지 조정합니다. 디지털 디스플레이 콘솔에서 x와 y를 재설정한 다음 bregma왼쪽레이저 1.8mm를 이동합니다. 이제 두개골을 만지지 않고 가능한 한 두개골에 레이저를 가까이 가져옵니다.
    2. 레이저를 bregma왼쪽 2.2mm로 이동하여 방해 없이 움직일 수 있도록 합니다. 레이저를 끕니다.
  5. 일회용 29G 바늘을 사용하여 적절한 양의 로즈 벵골 염료(IP)를 복전비(IP)에 주입한다. 즉시 7분 동안 타이머를 시작하여 염료가 체계적으로 순환할 수 있도록 합니다. 레이저를 켜지 않고 40mW의 사전 설정을 선택합니다.
    참고: 일단 절차에 익숙해지면, 염료는 마우스의 무균 준비 전에 주입하고 시간을 절약하기 위하여 7 분이 끝나기 전에 완료될 수 있습니다.
  6. 레이저 안전 고글을 착용하고 7분 타이머가 꺼지면 레이저(40mW)를 켜고 타이머를 10분 설정합니다.
    1. 10분 후, 레이저를 데그마 왼쪽 2.2mm로 옮기고 10분 타이머를 추가로 설정합니다.
    2. 두 번째 10분 타이머가 꺼지면 레이저를 다시 10mW로 변경하고 레이저를 bregma왼쪽 2.0mm로 이동합니다. 수술 마커로이 자리를 표시합니다. 그런 다음 레이저를 끕니다.
    3. 레이저를 들어 올려 마우스에서 멀리 이동할 수 있도록 90 ° 각도에서 잠금을 해제합니다. 이 시점에서, 수술 영역이 건조한 경우 멸균 식염수 또는 PBS를 면에 적용하십시오.
  7. 두개골 표면에 수직인 2.0mm 마크에서 작은 버스트에서 드릴.
    참고: 너무 깊게 드릴링하고 뇌를 때리는 것을 피하기 위해 천천히 드릴링하십시오. 드릴이 두개골을 통과하면 저항이 약간 떨어지면 약간의 하강 / 변화가있을 것이며 드릴링으로 출혈을 일으킬 수 있습니다.
    1. 면소재를 사용하여 과도한 혈액을 흡수합니다. 그것은 드릴링 후 두개골에 있는 별명동맥에서 몇몇 혈액을 보는 것이 일반적입니다 - 과도한 혈액은 드릴 비트가 두뇌를 명중한다는 것을 의미합니다. 이 경우 마우스 식별자를 기록하고 계속 합니다.
  8. 마우스 옆에 작은 닦아 놓습니다. 집게를 사용하여 피부를 가까이 당겨 접착제를 준비합니다.
    참고: 대신 이곳에서 는 봉합을 할 수 있습니다. 봉합은 일반적으로 3 봉합사만 필요합니다.
    1. 집게를 사용하여 피부의 양면을 잡고 함께 위로 당깁니다. 마우스에 바르기 전에 닦아 팁 끝에 수술 접착제의 큰 방울을 두드려.
    2. 수술 접착제를 아껴서 바르고 10s의 집게와 함께 피부를 유지합니다. 눈에 보이는 개구부가 없을 때까지 계속합니다.
      참고 : 접착제가 빨리 나옵니다 - 병을 짜내지 마십시오. 두개골에 피부를 접거나 눈에 접착제를 얻는 것을 피하십시오.
  9. 접착 또는 봉합 후, 마취에서 회복하기 위해 새 케이지에 마우스를 배치합니다. 동물이 회복하는 데 5-10 분이 걸리며 케이지의 절반을 가열 패드에 놓는 데 도움이됩니다.

3. 샴 스트로크 작업

  1. 로즈 벵골 염료 대신 1x PBS 또는 식염수를 주입하는 것을 제외하고 섹션 2에서 위에서 설명한 작업과 동일한 모든 절차를 수행하십시오.

4. 하이드로겔 또는 기타 생체 재료의 주입

  1. 사용자 정의 시간에 생체 재료의 주입을 수행합니다. 이 실험에서 주사는 뇌졸중 후 5일에서 7일 사이에 수행되었다. 2 - 하이드로겔의 6 μL이 주입됩니다 (사용자 정의).
    1. 마취(37°C) 동안 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 켭니다.
    2. 자동 가위, 집게, 면, 수의사 눈 연고, 수술 접착제 또는 봉합사 재료, 멸균 알코올 및 베타 요오드 물티슈를 준비하십시오. 멸균 드릴 비트 헤드와 금속 30G 바늘로 25 μL 유리 해밀턴 주사기로 뼈 드릴을 준비합니다.
    3. 비드 살균을 160°C로 켜서 마우스 간의 기기를 살균할 수 있습니다.
    4. 분사 펌프를 스테레오탁스 장치에 부착합니다. 유량을 1μL/min으로 설정하고 부피를 4μL로 설정합니다.
    5. 수술 후 마우스를 위한 깨끗한 케이지를 준비합니다.
  2. 마우스를 4%의 이소플루란 농도로 유도챔버에 넣고 자발적인 움직임이 멈추고 호흡이 느리고 꾸준한 속도로 나올 때까지 마취합니다.
    1. 일단 잠들면, 1.5%의 유지 보수 이소플루란 농도로 입체 장치에 마우스를 옮기고 고정한다.
    2. 수의사 눈 연고를 양쪽 눈에 바하십시오.
    3. 마우스의 머리를 다시 자란 털을 면도하고, 베타 요오드 와이프 다음에 알코올 닦아를 사용하여 영역을 무균적으로 준비합니다. 세 번 반복합니다.
      참고: 필요한 경우, 피부 자극을 일으키고 수술 후 두개골을 가려워쥐기 때문에 모든 베타 요오드를 청소하기 위해 마지막에 여분의 알코올 닦이를 사용하십시오.
  3. 작은 가위 및/ 또는 집게를 사용하여 뇌 위의 피부를 다시 엽니다. 멸균 식염수 또는 PBS가 있는 면소재를 사용하여 두개골의 잔해를 청소하십시오. 흰색-노란색 원(스트로크, 도 1B)과드릴의 버 구멍이 표시됩니다. 죽은 조직이 보이지 않는 경우, 가능성이 뇌졸중이 발생하지 않습니다. 버 구멍이 스트로크 위에 중심이 되지 않으면 다시 드릴하여 중앙에 배치합니다.
  4. 주입 펌프를 마우스 위로 방향을 지정하고 90°로 잠급됩니다. 재료를 백로드하기 전에 멸균 식염수 또는 PBS 용액으로 주사기를 청소하십시오.
    1. 일단 깨끗해지면 유리 주사기를 분해하여 바늘이 없도록 하십시오. 하이드로겔의 10 μL (또는 셀 유무이)의 10 μL와 함께 25 μL 양성 변위 파이펫을 사용하여 주사기를 역로드합니다.
    2. 주사기 플런저를 사용하여 젤을 주사기 앞쪽으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 주사기를 다시 조립하고 젤이 바늘에서 눈에 띄게 발산 될 때까지 계속 밀어 붙입니다.
  5. 주사기를 펌프에 놓습니다. 주사기가 맞도록 펌프 뒷면을 조정해야 할 수도 있습니다. 유량을 30 μL/min으로 조정하고, 이동하는 데 필요한 방향에 따라 인출 또는 주입을 선택한 다음 시작을누릅니다. 펌프 뒷면이 올바른 위치에 있을 때 정지를 누르십시오.
    1. 주사기가 안전할 수 있도록 펌프 뒷면을 나사로 고정합니다. 이전에 조정이 이루어진 경우 유량이 1 μL/min으로 다시 설정되어 주입하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
  6. 펌프를 x로 이동하고 y 방향으로 이동하여 구멍 위로 방향을 지정합니다. 주사기의 바늘이 구멍의 상단에 닿을 때까지 펌프를 z 방향으로 아래로 이동합니다.
  7. 디지털 디스플레이 콘솔에서 z를 재설정합니다. 그런 다음 주사기를 z 방향으로 0.750mm 아래로 이동합니다. 주사기가 구부러지거나 저항이 있는 경우 두개골이 치유되거나 완전히 뚫지 않아 다시 드릴링해야 합니다.
  8. 펌프 콘솔에서 시작하여 하이드로겔의 4~6μL을 1μL/min의 속도로 주입합니다.
  9. 젤이 교차 연결을 시작할 수 있도록 펌프 주입을 중지할 때 5분 타이머를 설정합니다.
  10. 5분 후, z 노브를 돌려 주사기를 천천히 당깁니다. 실수로 구멍에서 물질이 당겨지거나 누출되는지 확인하십시오. 펌프의 잠금을 해제하고 바늘이 두개골에서 충분히 멀리 있을 때 마우스에서 멀리 이동합니다.
  11. 집게, 수술 접착제 또는 봉합사를 사용하여 머리 위의 피부를 닫습니다. 깨끗한 케이지에 마우스를 넣고 회복을 관찰합니다. 마우스가 마취에서 회복하려면 약 5 ~ 10 분이 소요됩니다.

5. 관류 및 샘플 수집

  1. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다.
  2. 동물을 척추 위치에 고정하고 중앙분리대 절단으로 복강을 엽니다. 선택적으로, 내림차순 복부 대어를 클램프하여 덜 고정 및 PBS를 사용합니다.
  3. 다이어프램을 열고 흉곽의 측면을 위로 이동하여 가슴 구멍을 엽니다. 좌심실에 관류 캐뉼라를 삽입하고 오른쪽 아트리움의 개구부를 잘라냅니다. PBS의 10-20 mL 또는 액체가 반 투명하게 실행될 때까지 천천히 퍼퓨즈하기 시작합니다.
  4. 일단 명확, 다른 에 대 한 4% PFA로 전환 10 – 20 mL. 팔을 고정 해제하면 PFA가 주입됨에 따라 계약할 수 있습니다. 이동이 중단되면 30대 를 기다립니다.
  5. 동물을 참수하고 두개골을 노출하기 위해 피부를 다시 당깁니다. 무딘 얇은 집게를 사용하여 두개골 조각을 조심스럽게 제거하여 뇌를 노출시하십시오. 뇌졸중 부위 위의 두개골을 제거할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 작은 수술 가위는 두개골을 잘라 하는 데 도움이 여기에 사용할 수 있습니다. 가장 큰 과제는 두개골에 붙어 두개골이 제거될 때 뇌에서 나오는 젤입니다.
  6. 일단 두뇌가 분리되면, 10 - 15 mL의 4% PFA 하룻밤 (더 이상 24 시간)에 놓습니다.
  7. PFA에서 30%로 두뇌를 이동 다음 날 자당. 뇌는 바닥에 가라 앉으면 극저온 절에 대한 준비가되어 있습니다 (약 2 - 3 일). 이 시점에서 저장소에 보관할 수도 있습니다.

6. 냉동 절제 및 염색

  1. 자당에서 뇌를 꺼내 유리 슬라이드에 놓습니다. 면도날로 뇌 뒤쪽의 작은 부분을 잘라 서 척에 장착되는 평평한 부분을 만듭니다.
    1. 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)의 덩어리를 척에 놓고 뇌를 평평한 면을 10 월에 척에 놓습니다.
      참고: 10월은 단면 화 하는 동안 뇌에서 분리에서 물질을 방지 하는 데 도움이 뇌를 완전히 포괄 에 추가할 수 있습니다.
  2. 10젤라틴 코팅 슬라이드에 걸쳐 30 μm 두께의 섹션에서 -20 °C에서 냉동에 뇌를 연속적으로 잘라. 하이드로겔을 잃지 않도록 단면화할 때 주의하십시오. 이 부분이 어려운 경우, 젤 위에 뇌의 상단에 약간의 OCT를 배치(그림 3). 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
  3. -80°C에서 슬라이드를 꺼내 염색 트레이에 놓아 건조시 좋습니다. 고정되지 않았지만 단면된 슬라이드도 즉시 염색할 수 있습니다.
  4. 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 뇌 슬라이스 주위에 원을 그립니다. 일단 건조되면, 1x 여과 된 PBS로 뇌 슬라이스를 다시 수분화하고 15 분 동안 실온에서 셰이커에 놓습니다. 이 소요 약 1 슬라이드 당 버퍼의 mL 9 – 12 뇌 섹션.
  5. 실온에서 5 분 동안 1 x 필터링 된 PBS로 슬라이드를 씻고 세 번 반복하십시오.
  6. 10% 당나귀 세럼으로 30분에서 1시간 동안 슬라이드를 차단하여 배꼽 댄서의 실온에서 PBS-Triton X0.01%로 합니다. 슬라이드당 약 200μL가 소요됩니다.
  7. 1차 항체를 10% 당나귀 세럼에 0.01% PBS-Triton X를 쉐이커에서 4°C로 배양합니다. 올바른 농도를 결정하기 위해 먼저 1 차 적인 항체를 시험합니다. 여기서 GFAP (1:400), 이바1 (1:250), 글루1 (1:500)(그림 4)가사용되었다.
  8. 다음날 1x 여과 된 PBS로 슬라이드를 실온에서 5 분 동안 세 번 반복하십시오.
  9. 실온에서 실험실 셰이커에 2 시간 동안 0.01 % PBS-Triton X 및 DAPI에서 10 % 당나귀 세럼에서 이차 항체를 배양합니다. 1:1,000은 모든 보조 및 DAPI에 사용되었습니다.
  10. 1x 여과된 PBS로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.
  11. 어두운 실온에서 단면도를 건조시키십시오. 이 걸릴 수 있습니다 20 분 받는 데 4 시간; 슬라이드를 건조기에 배치하면 프로세스 속도가 빨라지수 있습니다.
  12. 50%, 70%, 95%, 100%, 100%의 알코올 농도(용액당 1분)의 탈수증이 미끄러진다.
  13. 자일렌의 첫 번째 목욕에서 1 분 동안 지방을 드린 다음 5 분 동안 자일렌의 두 번째 목욕.
  14. 빠르게 슬라이드를 하나씩 꺼내 고 장착 매체를 추가 하는 동안 두뇌 섹션 자일렌 젖은. 유리 커버슬립을 상단에 빠르게 추가합니다. 이미징에 사용되는 슬라이드 및 현미경에 필요한 정확한 길이와 두께의 커버 슬립을 각각 사용합니다.
  15. 슬라이드 의 중심에서 바깥쪽으로 움직임에 파이펫 팁으로 부드럽게 눌러 커버 슬립 아래의 거품을 제거합니다. 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 사이에 DPX가 건조할 수 있습니다.
  16. 면도날을 사용하여 슬라이드에 유출된 말린 마운팅 매체를 긁어냅니다. 렌즈 클리너로 슬라이드를 닦아냅니다. 슬라이드는 이제 형광 현미경 검사법으로 이미지화 될 수 있습니다.
    참고: 이미징이 완료될 때까지 어두운 또는 4°C에서 슬라이드를 저장하는 것이 가장 좋습니다.

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결과

이 방법의 목적은 뇌졸중 후 뇌에 생체 물질을 주입하는 방법을 시연하는 것이었습니다. 장미 벵골과 520 nm 레이저를 가진 광혈전 모델은 크기와 위치 모두에서 뇌졸중 병변의 제어 방향에 사용되었다. 뇌졸중 후 5일 동안 경색은수술(도 1B)및 TTC 및 이미징 IHC 염색 슬라이드(도2)에의해 시각화될 수 있다. 2x 렌즈를 가진 레이저 직경의 증가는 레이저만으로 단일 1mm 단면에 비해 2.5 mm 이상에 걸쳐 있는 치기 병변의 시각적 증가로 이끌어 낸다(그림2). PT 모형을 가진 수술 도중 사망은 거의, 최소침습 절차 때문에 1% 미만 일 일어나지 않습니다. 수술 후 사망은 또한 낮았고 마우스의 5% 미만에서 보였습니다.

히알루론산계 하이드로겔 미세입자(HMP)는 뇌졸중 후 5일 만에 주사하였다(도

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토론

여기서 우리는 쉽게 재현 할 수있는, 최소 침습, 영구 뇌졸중 모델을 설명하고 뇌졸중 후 5 일 동안 광원에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명합니다. 포토thrombotic 염료 로즈 벵골과 스테레오 탁스 장치에 연결된 520 nm 콜라주 레이저의 사용은 우리에게 향상된 정밀도로 마우스의 모터 피질에 스트로크를 배치 할 수있는 기능을 제공합니다. 뇌졸중 후 5일 후, 경색의 위치는 조사의 중심에 눈으로 볼 수 있으며, 2.0mm 메디오-측면은 브레그마에 있다. 하이드로겔은 주사기 펌프를 사용하여 스트로크 코어에 정확하게 주입됩니다. 수술 중 과 이 모형에 있는 치기 후에 사망은 마취합병증 때문에 수술 후에 정지하는 마우스의 소수와 함께, 사실상 결석합니다. 생체 재료 응용 프로그램에 PT 스트로크를 사용하는 장점에도 불구하고 해결해야 할 몇 가지 생물학적 제한과 기술적 어려움이 있습니다.

생물학적 한계의 관점에서, PT는 뇌 성 재관전옵션을 제공하는 뇌졸중 모델이 아니며, 인간의...

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공개 사항

저자는 TS가 MAP 하이드로겔을 상용화하고자하는 템포 치료제의 창시자라고 선언합니다.

감사의 글

우리는 건강의 국가 학회 및 자금 조달을 위한 신경 장애 및 치기의 국가 학회 (R01NS079691)를 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 일반 염소 혈청VWR100504-028차단 완충액
2겹 알코올 프리 패드, 멸균, 미디엄메드라인MDS090735
25uL Hamilton 주사기 702RN, 바늘 없음Fishcer Scientific14824663생체 재료 주입에 사용되는 주사기
25uL 용적형 변위 피펫GilsonM-25
2x 빔 확장기, 400-650nmThorlabsGBE02-A레이저 빔 확장기
조정 가능한 무대 플랫폼Kopf Instruments901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 항체, 토끼Abcamab113435
Anti-Iba1 항체, 염소abcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok 혈액 채취 세트. 25G, 12"Medsupply367294 관류
BKF12- 매트 블랙 알루미늄 호일ThorlabsBKF12레이저를 사용할 때 반사되는 모든 것을 덮습니다.
뼈 홍채 미니 가위 - 3-1/2"Sklar 수술 도구64-2035
C57BL/6 마우스잭슨 연구소000664 8-12주 된
케이지 어셈블리 RobThorlabsER3-P43" 길이, 지름 6mm, 4팩 - sterotax
탄소강 버에 레이저 부착용 -0.5mm 지름파인 사이언스 도구19007-05버 구멍 생성용
크롬 (III) 황산 칼륨 12 수화물VWREM1.01036.0250
피그 테일 레이저 용 소형 컨트롤러ThorlabsCLD1010LP
면봉VWR89031-288
CP 25 피펫 팁GilsonF148012
당나귀 안티 염소 IgG H & L (488)abcamab150129
당나귀 안티 토끼 IgG H & L (647)abcamab150075
당나귀 쥐 방지 IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElecron Microscopy Sciences13512슬라이드 용 마운팅 솔루션
EMS 젤라틴 파우더 타입 A 300 BloomElectron Microscopy Sciences16564젤라틴 코팅 슬라이드
EMS 파라 포름 알데히드, 과립VWR100504-16245 PFA
ESD Worstation kitElmstat제작 용WSKK5324SB레이저
파이버 벤치 월 플레이트, 나사산이 없는ThorlabsHCA3설정 필요 레이저를 Kopf 샤프트에 연결해야 함
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC& APC, f = 4.6mm, 350-700nm, 직경 0.75mm
미세 가위 - 스트레이트 / 샤프 블런트 / 10cmFine Science Tools14028-10
GFAP 항체, 쥐Thermo Fisher Scientific13-0300
가열판Kopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge 소수성 장벽 펜벡터 실험실H-4000슬라이드
염색 용IMPAC 6-통합 다중 환자 마취 센터VetEquip901808
요오드 준비 패드Medx SuppleMED MDS093917H
Jewlers 집게 #5GFS 화학 물질46085
레이저 보안경ThorlabsLG10B앰버 렌즈, 35% 가시광선(googles 버전도 사용 가능)
M27-1084 강력한 LED 듀얼 구스넥유나이티드 스코프LED-11C
의료 USP 등급 산소에어 가스OX USP250
Miltex Adson 드레싱 집게, 해부 등급Intefra MiltexV96-118
미니 코드 / 무선 소형 동물 트리머Harvard aparatus72-6110
미니 펌프 가변 흐름Thomas Scientific70730-064관류
용 펌프 마우스 뇌 매트릭스, 관상 슬라이스, 1mmKent ScientificRBMA-200cTTC 슬라이스
마우스 가스 마취 헤드 홀더Kopf Instruments923-B
Nanojet Control BoxChemyx10050
Nanojet 펌프 헤더Chemxy10051생체 재료 주입을위한 입체 장치에 부착
바늘 RN 30G PT STY 3, 0.5 인치Fishcer Scientific
비파열 이어바 60ºKopf Instruments922
PBS 버퍼 pH 7.4VWR97062 338
Pigtaled 레이저 520 nm, 100mW, 5G 핀ThorlabsLP520-MF100
양전하 유리 슬라이드HaretaAHS90-WH
전력 에너지 측정기ThorlabsPM100DmW 레이저 출력을 측정하는 데 사용
Puralube Vet 연고Dr. Foster Smith9N-76855
직장 탐침 마우스kopf InstrumentsRet-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Shaft Modified 8-32 나사식 구멍 1/2" 깊이Kopf Instruments1770-02레이저를 스테로택시 장치에 연결하기 위해
슬림 포토다이오드 파워 센서ThorlabsS130VC전력 에너지와 함께 사용됩니다. 미터
SM1-Threaed 30 mm 케이지 플레이트 0.35 "두께 2 고정ThorlabsCP02레이저 확장기
Sol-M U-100 Insuline 주사기와 1/2 단위 표시 연결용 0.5 mLVWR10002-726로즈 벵골
주입 StainTray 슬라이드 염색 시스템Simport ScientificM920-2염색 슬라이드용
스테로택시 장치Kopf Instruments940작은 동물 스테레오택시 기구
학생 Adson 펜치 -1x2 치아Fine Science Tools91127-12
학생용 Fine Funches - 직선/넓은 ShanksFine Science Tools91113-10
온도 컨트롤러Kopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT 화합물VWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
상부 브라켓 클램프Kopf Instruments1770-c레이저를 스테로택시 장치에 연결하기 위해
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional My ManicuristBargin Source6400For Burrs
VWR 비드 살균기VWR75999-328
Tissue Tek OCT compoundSakura4583조직 매립용
NC9459562

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