이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

3.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

2020년 6월 23일

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

이 논문에서

요약

미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성 평가는 분자 프로파일링 연구에 중요한 기능적 차원을 제공할 수 있습니다. 우리는 유세포 분석을 사용하여 마우스 모델에서 급성 분리된 미세아교세포와 뇌 대식세포에 의한 형광 미세구 및 아밀로이드 베타 피브릴의 식세포작용을 빠르고 안정적으로 정량화하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

총칭하여 CNS 단핵 식세포(CNS-MP)라고 하는 미세아교세포와 중추신경계(CNS) 침투 대식세포는 신경변성 및 뇌졸중을 포함한 신경 질환에서 중심적인 역할을 합니다. CNS-MP는 병리학적 단백질, 파편 및 신경 세포 시냅스의 식세포 제거에 관여하며, 각각 고유한 기본 분자 경로를 가지고 있습니다. 이러한 식세포 특성을 특성화하면 기존의 유세포 분석, 전사체학 및 단백질체학 접근법을 사용하여 미세아교세포의 분자 프로파일링을 보완하는 기능적 판독값을 제공할 수 있습니다. 미세아교세포의 식세포 프로파일링은 마우스 신생아 미세아교세포의 현미경 시각화와 체외 배양에 의존해 왔습니다. 전자의 접근법은 제한된 샘플링으로 어려움을 겪는 반면, 후자의 접근법은 본질적으로 성인 CNS-MP의 실제 생체 내 상태를 제대로 반영하지 못합니다. 이 논문은 유세포 분석을 통해 급성 분리된 마우스 CNS-MP의 식세포 특성을 표현형하기 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배 원심분리를 사용하여 성체 쥐의 뇌에서 급성으로 분리하고, 형광 미세구 또는 형광 Aβ 원섬유로 배양하고, 세척한 다음, 표면 마커(CD11b, CD45)에 대한 항체 패널로 표지합니다. 이 접근법을 사용하면 뇌 상주 미세아교세포와 CNS 침투 대식세포의 식세포 특성을 비교한 다음 이러한 식세포 표현형에 대한 노화 및 질병 병리의 영향을 평가할 수 있습니다. 이 신속한 방법은 또한 사후 검시 또는 수술 뇌 표본에서 급성으로 분리된 인간 CNS-MP를 기능적으로 표현형화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, CNS-MP subset에 의한 식세포작용의 특정 메커니즘은 선택적 식세포 경로를 억제하여 조사할 수 있습니다.

서론

중추신경계(CNS)의 선천성 면역 세포는 주로 미세아교세포와 침윤 단핵구/대식세포로 구성되며, 이를 통틀어 CNS-단핵 식세포(CNS-MPs)라고 합니다1. CNS-MP는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 신경염증성 질환, 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있다 2,3,4. CNS-MP는 성상세포(astrocyte), 주위세포(pericyte) 및 뇌실막세포(ependymal cell)와 함께 식세포 기능을 가지고 있습니다 5,6. 항상성 상태에서 CNS-MP는 자가사멸 세포 파편 및 단백질의 식세포 제거, 뉴런 연결을 리모델링하기 위한 시냅스 가지치기와 함께 국소 미세환경에 대한 지속적인 감시에 관여합니다 7,8,9,10. 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에서 CNS-MP는 응집된 아밀로이드-베타(Aβ) 및 신경 요소의 제거, 염증성 사이토카인 및 인자 방출을 포함한 병리학적 역할을 할 수 있는 뚜렷한 질병 관련 분자 및 기능적 표현형을 채택하여 복잡한 전염증, 해로운 및 항염증, 보호 역할을 수행할 수 있습니다 11,12,13,14. CNS-MP에 의한 거대 입자, 세포 파편, 단백질 및 기타 감염 입자의 식세포작용은 표면에 발현되는 별개의 수용체에 의해 매개됩니다9. 이러한 식세포 경로의 붕괴는 결함 제거와 Aβ의 점진적인 축적으로 이어질 수 있으며, 궁극적으로 AD 4,9에서 진행성 신경 세포 손상으로 이어질 수 있습니다. 전사체(transcriptomic) 및 단백질체학(proteomic) 접근법을 사용한 CNS-MP의 분자 프로파일링의 발전은 신경 질환에서 CNS-MP 내의 분자 이질성에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만(15,16), CNS-MP와 그 하위 집합의 식세포 특성에 대한 기능적 특성화는 현재 부족합니다. CNS-MP의 식세포 특성의 기능적 특성화는 분자 프로파일링 전략을 보완하고, 더 나은 기능적 표현형을 촉진하며, 질병 모델에서 결함 있는 식세포작용을 교정할 수 있는 치료제의 효능을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다17.

CNS-MP에 대한 전통적인 식세포작용 분석법에는 Aβ 또는 라텍스/폴리스티렌 입자와 같은 형광 기질과 함께 1차 미세아교세포를 배양하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 식세포작용(phagocytosis)을 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 형광 기질의 흡수 함수로 연구합니다 18,19,20. CNS-MP가 긴 배양에서 유지될 때 형태와 전사 프로파일을 극적으로 변화시킬 수 있다는 것은 잘 알려진 사실입니다21,22. 이는 CNS-MP의 대리 상태에서 CNS-MP의 식세포 특성을 연구하는 데 방해가 됩니다. 급성 분리된 살아있는 CNS-MP를 프로파일링하기 위한 기능적 유세포 분석 분석은 식세포 특성을 신속하게 평가할 수 있으며 현미경 접근 방식보다 훨씬 더 큰 CNS-MP 풀을 샘플링할 수 있습니다 9,23. 또한, 유세포 분석은 배양에서 CNS-MP를 유지할 필요성을 없앨 뿐만 아니라 CNS-MP의 다양한 하위 집단에서 식세포 특성을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 원고는 유세포 분석을 통해 급성으로 분리된 마우스 CNS-MP의 식세포 특성을 표현형하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 유세포 분석을 사용하여 phagocytosis assay를 조정하면 면역 표현형과 결합된 CNS-MP의 phagocytic 표현형을 신속하게 multiplexing할 수 있으므로 단일 세포 분해능에서 CNS-MP 내 phagocytic 특성의 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 마우스 연구는 Emory University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 후 수행되었으며 National Institutes of Health의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 격리 당일의 준비

  1. 분리 절차 전반에 걸쳐 모든 시약, 완충액 및 세포 현탁액을 차갑게 유지하기 위해 얼음 양동이를 준비합니다.
  2. 관류 전 30분에서 1시간 동안 4°C에서 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 병(최소 1L)을 놓고 관류 및 분리 절차 동안 1× PBS를 얼음 위에 보관합니다.
  3. 밀도 구배 매체의 작업 농도를 준비합니다(35% SIP라고 함, 재료 표 참조).
  4. 세포 분리 전에 실험에 사용된 모든 원뿔형 및 유세포 분석 튜브에 라벨을 부착하여 처리 시간 지연을 방지합니다. 또한 관류 전에 분리에 필요한 다른 모든 공급품(예: 40μm 세포 여과기, 주사기 및 바늘)을 수집합니다.

2. 성체 마우스 미세아교세포의 급성 격리

  1. 성체 쥐가 호흡을 멈추고 뒷다리 발 꼬집음에 반응하지 않을 때까지 이소플루란(5mL)이 함유된 유리 유도 챔버에 마우스를 넣어 마취합니다.
  2. 26G 바늘과 10mL 주사기를 사용하여 30mL의 얼음처럼 차가운 1× PBS로 시각적 혈액이 없을 때까지 심장 관류를 수행합니다.
  3. 수술 용 가위로 마우스의 목을 베십시오. 작은 가위를 사용하여 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다. 설명된 대로 뇌 조직을 손상시키지 않고 두개골을 제거합니다24. 즉시 뇌를 제거하고 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 멸균 40μm 세포 여과기로 옮깁니다.
  4. 3mL 주사기의 플런저 뒷면을 사용하여 스트레이너를 통해 뇌를 밀어 넣고 전체 뇌 조직을 기계적으로 해리합니다. 해리 중에 세포 스트레이너와 플런저를 간헐적으로 세척할 때마다 얼음처럼 차가운 1×PBS 2mL를 사용하여 모든 조직이 스트레이너를 통과하도록 합니다.
  5. 플런저로 셀 스트레이너의 바닥을 긁어 잔류 현탁액을 원뿔형으로 수집합니다. 얼음처럼 차가운 1× PBS로 셀 스트레이너를 완전히 세척하고 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다.
    참고: 여러 동물을 직렬로 처리할 때는 추가 처리가 있을 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 놓으십시오.
  6. 얼음처럼 차가운 1× PBS를 추가하여 세포 현탁액을 30mL로 늘리고 800×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
  7. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 붓고 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 35% SIP 6mL에 펠릿을 다시 현탁합니다. 셀 현탁액 + 35% SIP 혼합물을 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 800× g 의 원심분리기를 브레이크 없이 15°C에서 25분 동안 가열합니다.
    주의 : 재서스펜션 중에 기포가 유입되지 않도록 특히 주의하십시오. 과도한 기포는 세포 수율에 해로울 수 있습니다.
  8. 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 15mL 원뿔형 튜브를 조심스럽게 제거하고 상단 부동 미엘린 층을 흡인합니다.
  9. 10mL 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액 + 35% SIP 혼합물을 30mL의 얼음처럼 차가운 1× PBS와 800×g의 원심분리가 포함된 새로운 50mL 코니컬 튜브로 4°C에서 5 분 동안 옮 깁니다. 상층액을 조심스럽게 붓고 500\u2012800 μL의 1× PBS와 함께 세포 펠릿을 남깁니다.
  10. p1000 피펫으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 5mL 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 둥근 바닥 튜브에 얼음처럼 차가운 1× PBS 2mL를 넣고 1,400×g의 4°C에서 2 분 동안 원 심분리합니다. CNS-MP가 포함된 세포 펠릿을 약 100μL의 1× PBS에 남겨두고 상등액을 빠르게 붓습니다(그림 1).

3. 식세포작용(Phagocytosis) 설정 및 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)

  1. 재현탁된 CNS-MP 20μL(≈200,000개 세포)를 새로운 5mL 원형 바닥 튜브로 옮기고 80μL의 얼음처럼 차가운 1× PBS를 추가합니다. 이 튜브에 형광 기질 또는 유세포 분석 항체를 추가하지 마십시오. 이 세포는 유세포 분석을 위한 CNS-MP의 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군 역할을 합니다.
  2. 분리된 CNS-MP의 생존력을 확립하려면 아민 기반 생/사체 염료(예: Fixable Blue UV)를 사용하십시오.
    1. 나머지 세포 펠릿을 500μL의 1×PBS에 재현탁시키고 음성 대조군을 제외한 각 샘플 튜브에 1μL의 재구성된 염료를 추가합니다.
    2. 부드럽게 소용돌이치고 튜브를 호일로 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 1× PBS 1mL를 넣고 부드럽게 와류를 칩니다.
    3. 1,400 × g 에서 4°C에서 2분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 빠르게 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1× PBS에 다시 현탁시킵니다.
      참고: 아민 기반 염료는 세포외 Aβ 원섬유에 결합하여 식세포작용의 결과를 혼동합니다. 다른 live/dead 지표는 Aβ 원섬유/미세구의 형광을 방해할 수 있습니다. 따라서 분리된 CNS-MP의 생존 가능성을 확립하기 위해 예비 실험에서만 Live/dead 지표를 사용하는 것이 좋습니다.
  3. PE-폴리스티렌 미세구가 포함된 튜브를 철저히 와류로 처리하고, 네거티브 대조군을 제외한 플로우 튜브의 100μL의 세포 현탁액에 2 μL(≈200 마이크로스피어/셀)를 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 기질과 세포가 균등하게 분포되도록 하고 둥근 바닥 튜브를 30°C에서 37% CO2로 3분 동안 멸균 가습 인큐베이터에 넣습니다.
    1. 음성 제어 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 배양하여 양성 샘플과 음성 샘플 간에 유사한 실험 조건을 보장합니다.
      참고: PE 미세구 대신 Aβ 원섬유를 사용하는 경우 앞서 설명한 대로 형광 HiLyte488 Aβ 원섬유를 준비합니다9. Aβ 피브릴의 최종 농도는 200μM이며, 이를 희석하여 형광 Aβ 단량체의 PBS에 새로운 20μM 스톡을 준비합니다. 분리된 세포를 포함하는 각 튜브에 20μM 스톡 Aβ 단량체 12.5μL를 추가합니다.
  4. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 각 튜브에 1× PBS 1mL를 추가하고 부드럽게 와류를 칩니다. 1,400 × g의 세포를 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리하고 상층액을 빠르게 붓습니다. 1mL 1× PBS로 세척을 반복하고 1,400 × g 에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1×PBS에 다시 현탁시킵니다.
    참고: 각 회전 후에는 지속적인 식세포 흡수를 억제하기 위해 세포를 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다.
  5. 유세포 분석 항체를 소용돌이치고 마이크로 원심분리기에서 10초 동안 원심분리합니다. 각 세포 부유 튜브에 Aβ 식작용 분석을 위해 CD11b-APC/Cy7 및 CD45-PE/Cy7을 각각 1μL씩 첨가하거나 PE-마이크로스피어 식작용작용의 경우 CD45-FITC를 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
    참고: 사용자는 배양된 BV2 미세아교세포 또는 복막 대식세포와 같은 강력한 식세포 세포를 포함하는 별도의 튜브를 양성 대조군으로 포함하고 위에서 설명한 대로 PE 마이크로스피어 및 유세포 분석 항체로 처리할 수도 있습니다. 이 샘플의 데이터는 예비 실험에서 진정한 식세포작용(phagocytosis)을 나타내는 양성 대조군을 정의하는 데 사용할 수 있습니다.
  6. 세포가 배양되는 동안 4개의 둥근 바닥 5mL 유류 튜브를 사용하여 보상 튜브를 설정합니다. 보상 비드를 완전히 와류로 만들고 각 튜브에 1방울을 추가합니다. 첫 번째 튜브에 1μL의 CD11b-APC/Cy7을 추가하고 두 번째 튜브에 CD45-FITC를 추가합니다. 세 번째 튜브에 1μL의 PE-폴리스티렌을 추가하고 네 번째 튜브에 염색되지 않은 보상 비드를 유지합니다. 이 네 번째 튜브를 negative control로 사용하여 유세포 분석기에 compensation panel을 설정합니다.
    참고: Aβ 피브릴을 사용하여 식세포작용을 연구하는 경우 CD45-FITC 대신 CD45-PECy7을 두 번째 튜브에 추가합니다. 세 번째 보상 튜브에 1 μL의 별도 FITC 태그 유세포 분석 항체 또는 FITC-2차 항체(모든 종)를 추가합니다. 이는 비드가 Aβ 피브릴에 결합할 수 없고 보상 튜브를 세척할 때 씻겨 나가기 때문에 중요합니다.
  7. 보상 비드가 최소 10분 동안 각각의 항체와 함께 배양하도록 합니다. 배양 후 각 튜브에 1× PBS 1mL를 첨가하고 4°C에서 2분 동안 1,400 x g 에서 원심분리한 후 상등액을 빠르게 붓습니다. 보상 튜브를 얼음 위에 놓고 유세포 분석이 나올 때까지 호일로 덮습니다.
  8. 유세포 분석 항체를 배양한 후 염색된 세포를 1× PBS 1mL로 세척합니다. 1,400 × g 의 세포를 4 °C에서 2 분 동안 부드럽게 와류시키고 원심 분리합니다. 상층액을 빠르게 붓고 1mL 1×PBS로 세척을 반복합니다. 원심분리 후 상층액을 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1× PBS에 다시 현탁시킵니다.
  9. 샘플 튜브를 얼음 위에 놓고 유세포 분석이 이루어질 때까지 알루미늄 호일로 덮습니다.
    참고: 실험 전반에 걸쳐 흐름 버퍼로 Ca2+/Mg2+ 없이 1× PBS(pH 7.0)를 사용합니다. 미세아교세포(microglial) 활성화 가능성을 피하기 위해 흐름 완충액에서 소 태아 혈청(FBS)을 제외해야 합니다.

4. 유세포 분석 및 분석

  1. 기기 설정 및 보정
    참고: 이 원고의 실험은 자외선, 보라색, 청색, 황록색 및 적색 레이저를 사용하여 유세포 분석기에서 수행되었습니다. 이 실험은 청색, 황록색 및 적색 레이저만 있는 3 레이저 유세포 분석기에도 적용할 수 있습니다. 사용자는 기기를 다루기 전에 공식 교육을 받아야 합니다.
    1. 유동 덮개 버퍼 탱크를 다시 채우고 세포 분석기를 켭니다. ddH2O가 들어있는 5mL 둥근 바닥 유동 튜브로 유세포 분석기를 "프라임"합니다. 유세포 분석기에 연결된 컴퓨터의 분석 소프트웨어에 로그인합니다. "실험"을 만들고 FSC, SSC, FITC, PECy7 및 APC-Cy7을 매개변수로 선택합니다. PE 마이크로스피어를 사용하는 경우 매개변수 패널에서 PECy7 대신 PE를 선택합니다.
    2. 적절한 보정 패널을 만듭니다.
      참고: 실험에서 일반적으로 보상 비드의 FSC/SSC 전압은 약 350/280인 반면 CNS-MP의 FSC/SSC 전압은 약 320/260입니다. 이 값은 두 개의 서로 다른 세포 분석기 간에 다를 수 있으며 실제 실험 전에 보정해야 합니다.
    3. 각 보상 튜브와 세포 현탁 튜브를 500μL의 1× PBS로 재구성하고 잠시 와류를 일으킨 다음 얼음 위에 놓습니다. negative control/unstained bead tube를 실행하여 각 형광단 히스토그램의 피크가 102 미만이 되도록 적절한 전압을 설정합니다. 다른 단색 compensation tube를 실행하여 뚜렷한 positive peak를 식별합니다.
      참고: 각 형광단의 positive peak와 negative peaks 사이에는 최소한 절반 log(base 10) 차이가 있어야 합니다.
    4. 컴퓨터가 보상 설정을 자동으로 계산할 수 있도록 각 보상 튜브에서 5000개의 이벤트를 기록합니다. 보상 설정을 현재 실험(25)에 연결한다.
    5. 샘플 탭 아래에 새 "튜브"를 만듭니다. 염색되지 않은 CNS-MP가 들어 있는 음의 제어 튜브를 부드럽게 와류로 돌리고 실행합니다. 순방향 및 측면 산란 전압을 조정하여 관심 모집단을 캡처합니다. 아래에 언급된 대로 라이브 CNS-MP에서 이벤트와 서브 게이트를 기록합니다.
    6. 모든 후속 튜브의 이벤트를 별도의 파일로 캡처하고 기록하여 매개변수와 전압을 일관되게 유지합니다. 유세포 분석기에서 실행하기 전에 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오.
  2. 게이팅 전략과 phagocytosis의 측정
    1. 모든 CNS-MP를 포획하기 위해 초기 단핵 게이트를 그립니다. 이러한 살아있는 단핵 세포는 커플렛과 트리플렛을 제외한 단일 세포만 포함하도록 다음 그래프에서 게이트되어야 합니다.
    2. 게이트된 단일 라이브 CNS-MP 집단을 CD11b 및 CD45 형광단을 표시하는 후속 그래프에 투영합니다.
      참고: 뇌에 상주하는 미세아교세포는 일반적으로 CD11b+CD45중간체인 반면, 침투 대식세포는 CD11b+CD45높음입니다. Ly6c와 같은 추가 마커를 패널에 포함하여 염증성 단핵구(Ly6c높음 및 CD45높음)와 미세아교세포(Ly6c낮음 CD45중간)를 더욱 확실하게 분리할 수 있습니다.
    3. 그림 2F와 같이 각 집단에서 식세포작용(phagocytosis)을 추가로 연구하기 위해 적절한 게이트를 적용합니다.
      참고: CNS-MP의 식세포작용은 Hilyte488/Alexa488(Aβ) 또는 PE(마이크로스피어) 형광 흡수의 함수로 측정됩니다. 각각의 히스토그램에서 뚜렷한 positive peak는 CNS-MP가 기질을 식세포화했음을 나타냅니다. phagocytosed 물자의 양은 형광의 강렬에 정비례합니다. 따라서 여러 피크의 존재는 더 높은 식세포작용으로 해석되어야 합니다. 이는 이후에 면역조직화학에 의해 확인될 수 있습니다.
    4. 유세포 분석기에 모든 샘플 튜브를 기록한 후 추가 분석을 위해 데이터 파일을 .fcs 형식으로 내보냅니다.
  3. 통계 데이터 분석
    1. 모든 데이터 분석을 위해 스프레드시트 및 통계 분석 소프트웨어와 함께 유세포 분석 소프트웨어를 사용하십시오.
    2. .fcs 파일을 해석 소프트웨어에 추가하고 첫 번째 파일을 두 번 클릭합니다. 기록된 모든 항목을 표시하는 그래프
      이벤트가 나타납니다. 그림 2 에 표시된 것과 유사한 게이팅 전략을 따라 살아있는 단핵 세포를 게이트하고 특정 집단(예: CD11b+CD45중간 미세아교세포)에 대한 식세포작용을 연구합니다(그림 2H).
      참고: 식세포 지수는 형광 Aβ 원섬유(fibril) 또는 ≥1 마이크로스피어(microsphere)를 내재화하는 세포의 비율을 기준으로 평가됩니다. 앞서 정의한 바와 같이, lowlevel phagocytosis는 최소 1 microsphere의 흡수이고 high-level phagocytosis는 >1 bead uptake 8,9입니다. 선행 실험에 의하면, cytochalasin D에 의한 actin-dependent process의 억제는 >1 bead upup을 완전히 억제하고 1 bead uptake9를 부분적으로 억제할 뿐만 아니라 Aβ uptake를 완전히 억제하여 세포 표면에 대한 passive binding이 아닌 actin-dependent phagocytic upup을 확인하였다. Immunocytochemistry는 또한 마이크로스피어 분석의 각 순차적 피크가 8,9 식세포화된 비드 수의 단일 증가를 나타낸다는 것을 확인합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

급성 고립된 CNS-MP에 의한 미세구 및 Aβ42 피브릴의 식세포 흡수의 전형적인 결과를 예시하기 위해, 과도성 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 8 후 동측 반구에서 급성 고립된 CNS-MP를 얻었습니다. MCAO 모델에서 CNS-MP의 식세포 특성에 대한 자세한 내용은 이전 간행물8을 참조하십시오. 간단히 말해서, 72시간의 회복 후 CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배 원심분리를 사용하여 새로운 뇌에서 급성으로 분리하고 형광 미세구 또는 Aβ 피브릴로 배양했습니다(그림 1). 그 후, CNS-MPS를 CD11b 및 CD45의 두 가지 표면 마커에 대한 형광 접합 항체 패널로 라벨링하고 유세포 분석기에서 미세구 또는 Aβ 원섬유의 식세포 흡수를 분석했습니다(그림 1). 이 프로토콜은 노화, 진행성 신경병리학 및 허혈성 뇌

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

유세포 분석(Flow-cytometry)은 형광 표지 프로브(일반적으로 항체)를 사용하여 세포 표면 또는 세포 내 구획에서 관심 있는 단백질 또는 마커의 발현을 검출하여 이러한 관심 마커를 라벨링할 수 있는 기술입니다. 세포 표면 또는 세포 내 항체는 일반적으로 고유한 방출 스펙트럼을 가진 레이저 여기성 형광 색소와 결합됩니다. 이러한 항체로 배양된 세포는 이러한 마커의 발현 패턴에 따라 여러 하위 집단으로 분류할 수 있습니다. CNS-MP는 주로 미세아교세포와 CNS 침투 단핵구/대식세포를 포함합니다. 미세아교세포와 CNS 단핵구/대식세포는 뚜렷한 기능적, 분자적 특성을 가지고 있으며, 이는 알츠하이머병과 같은 질병 상태에서 추가로 변경될 수 있습니다. CNS의 대표 상태에서 최소한의 조절로 이러한 차이를 특성화하는 것은 유세포 분석 접근법을 사용하여 촉진할 수 있습니다. 이 원고는 급성 분리된 CNS-MP의 식세포 특성을 신속하게 평가하고 기존 방법에서 일반적으로 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Rangaraju 박사(NINDS K08 NS099474-1 및 R01 NS114130-01A1)와 Rayaprolu 박사(NIA F32AG064862)에게 NIH 상을 수여했습니다. 이 연구는 EICF(Emory Integrated Core Facilities) 중 하나인 EFCC(Emory Flow Cytometry Core)의 일부 지원을 받았으며 Emory University School of Medicine의 보조금을 받았습니다. NIH의 Georgia Clinical & Translational Science Alliance(UL1TR002378)에서 추가 지원을 제공했습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 NIH의 공식 견해를 반드시 반영하는 것은 아닙니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x Hank's Balanced Salt Solution(10x HBSS)ThermoFisher14065056Store at 4 °C. 프로토콜에 설명된 대로 SIP를 만드는 데 사용됨
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)ThermoFisher14175095Store at 4 °C. 프로토콜에 설명된 대로 35% SIP를 만드는 데 사용됨
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html 10xPBS를 실온에서 보관하십시오. 10xPBS 1부를 MilliQ dH20 9부에 희석하여 새로운 1xPBS를 준비하고 4°C에 보관합니다. C를 복용하기 전에 한 시간 동안 복용하십시오. 냉장 보관하기 전에 1xPBS의 pH가 7.0인지 확인하십시오.
35% SIP35% SIP 20mL를 만들려면 SIP 7mL와 얼음처럼 차가운 13mL를 1회 사용하십시오. HBSS. 추가 처리
APC-Cy7 쥐 anti-CD11bBD Pharmingen 5576574 °에서 저장 때까지 얼음에 보관하십시오. C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 유세포 분석 희석 - 1:100
FITC 쥐 안티 마우스 CD145BD Pharmingen553080에 보관; C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 플로우 사이토메트리 희석 - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermoFisherL34961-20°C에서 보관. 염료 튜브 하나에 DMSO 50ul을 추가하고, 전체적으로 소용돌이치며 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다. 10µ를 만듭니다. L 부분 표본을 사용하여 -20 °C에서 보관합니다. 각 실험에 대해 새로운 부분 표본을 사용하고 1:500 희석으로 샘플에 추가합니다.
OneComp eBeads 보상 비즈ThermoFisher01-1111-424 ° C, 샘플 튜브에 추가하기 전에 튜브를 완전히 와류로 만들고 사용 중에는 얼음에 보관하십시오.
PE-Cy7 쥐 안티 마우스 CD145BD Pharmingen5528484 °에 저장; C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 유세포 분석 희석 - 1:100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP16444°C에 보관 표준 Isotonic Percoll (SIP)의 10 mL를 만들기 위하여는: 찬 Percoll의 9 mL 및 찬 10times의 1개 mL를 사용하십시오; HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheresThermoFisherF13083Store at 4 ° C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오.
β - 아밀로이드 (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - 표지, 인간AnaSpecAS-60479-01Ab 섬유의 최종 농도는 200µ입니다. 그런 다음 사용하기 전에 희석합니다. -20°C에서 보관하십시오. 각 실험에 대해 새로운 작업 용액을 준비합니다.
4°C

참고문헌

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CD11b CD45
동영상 곧 제공
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.