해마 신경 발생을 연구하기 위한 도구로서의 무선 전기생리학 및 기억 행동 테스트의 동시 모니터링

행동 테스트는 생체 내 맥락에서 생성된 많은 양의 정보에 대한 신경과학 연구에서 매우 중요합니다. 이와 관련하여 연구자들은 감각-운동 기능, 사회적 상호 작용, 불안 유사 및 우울 유사 행동, 물질 의존 및 다양한 형태의 인지 기능을 분석하기 위해 다양한 행동 테스트를 널리 사용하고 있습니다¹. 행동 테스트를 수동으로 기록하는 것은 대부분의 전문 관찰자에게도 어렵고 지치고 부정확할 수 있습니다. 행동 등록을 위한 무료 오픈 소스 소프트웨어(예를 들어, 성행위를 위한 sexrat male² 앱)를 개발하기 위한 몇 가지 노력이 있었지만, 몇 가지 대안을 통해 물고기(fish 3)에서 설치류(installed ^4,5,6)에 이르기까지 다양한 동물 종의 자동 및 실시간 행동 기록을 허용하고 있다. 비디오 트래킹은 다양한 어플리케이션에서 사용되는 빠르고 정확한 행동 기록을 위한 유용한 방법이다⁷. 행동 기록 영역에서 더 잠재적인 기능은 행동 발현 동안 신경 활동을 탐색하는 것입니다. 뉴런 활동(단세포에서 주요 뇌 영역까지)과 행동 과제를 동시에 기록하면 뇌가 어떻게 특정 행동 패턴을 생성하는지 알 수 있다⁸. 행동은 신경 활동과 움직임 또는 행동 사이의 상관 관계를 나타낼 수 있는 일련의 사소한 구성 요소입니다. 뉴런 활동과 행동 패턴이 여러 시간 척도를 통해 동시에 기록될 수 있다면 각 뇌 상태가 각 특정 행동과 어떻게 상관관계가 있는지 설명할 수 있습니다(행동 기록에 대한 보다 심층적인 조사는 Datta et al., 2019 리뷰⁸ 참조). 따라서 원하는 규모 (뉴런에서 뇌의 넓은 영역까지)에서 행동 및 신경 활동을 동기화 된 기록은 매우 유용한 도구로 간주됩니다. 행동 기록을 신경 활동과 같은 다른 측정치와 통합하기 위한 몇 가지 시스템이 있다 ^4,5.

뇌파 검사는 임상 및 연구 신경과학 분야에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나로 간주되지만, 상대적으로 높은 이동성과 EEG 기록 장치의 크기로 인해 이 기술은 생체 내 모델⁹의 경우 독특하고 탐지하기 어렵다. 이 문제에 대한 몇 가지 해결책이 개발되었습니다 (예 : 동물이 경기장에서 자유롭게 움직일 수 있도록하는 케이블 및 회전 장치 사용). 그럼에도 불구하고, 케이블 기반 시스템은 종종 연구를 수행하는 데 문제를 부과합니다., 예를 들어, 한 케이지에서 다른 케이지로 동물을 옮기는 동안, 케이블과 동물의 방해 또는 얽힘이 관찰됩니다. 원격 측정 장치는 기록 상황^{(10, 11})의 유연성을 증가시키기 위해 무선 전기생리학적 기록을 위해 개발되었다. 그러나, 이러한 시스템들은 그들의 적은 수의 기록 채널들 및 낮은 샘플링 레이트들¹¹로 인해 상당한 한계를 나타내었다. 이 연구에서, 우리는 자유롭게 움직이는 설치류 시스템⁽¹²)과 Wi-Fi 연결을 통해 동물로부터 EEG 신호를 전송하는 상업적으로 이용 가능한 무선 시스템을 사용하였다. 이 장치의 무게는 6g이며 1kSps로 기록된 최대 16개의 채널을 지원합니다. 이 시스템은 동물 환경에서 EEG 또는 스파이크 기록을 허용하고 방해를 줄여 시장의 기존 전기생리학적 시스템에 비해 경제적인 솔루션 역할을 합니다. 또한 EEG와 행동 패턴 간의 상관 관계를 제공하기 위해 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 이 데이터를 동기화했습니다. 이 동기화는 두 시스템에서 생성된 타임스탬프를 기반으로 데이터와 이벤트를 정렬 및 보간하여 오프라인으로 수행되며 MATLAB에서 처리됩니다.

성인 신경 발생은 동물의 치아 이랑에서 새로 생성 된 세포의 뉴런에서의 증식, 생존 및 분화로 정의됩니다^13,14. 이 과정은 풍부한 환경(enriched environment, EE) 조건을 통해 설치류에서 성체 신경발생을 증가시키는 기억력 및 학습 향상과 관련이 있는 것으로 알려져 있다¹⁵. EE는 장난감과 튜브가 제공되는 대형 케이지 안에 설치류를 소그룹으로 수용하는 것으로 구성되며, 동물은 새롭고 복잡하지만 생물학적 관련성이 없습니다¹⁵. EE는 해마 신경 발생을 자극하지만 연령, 동물 균주, 특정 자극 조건 또는 신경 발생 검출 절차와 같은 많은 요인에서도 다양합니다. 7일 동안 EE 하우징에 노출된 중년 마우스에서, 해마 치상회(DG)에서 새로운 과립 세포(GC)의 탄생이 보고되었다¹⁶. 성체 쥐에서 성체 신경발생을 선택적으로 제거하려는 연구에서는 학습된 반응에 약 1 - 2주령의 새로운 과립 세포가 필요하다는 것을 시사했다¹⁷. GC가 성인 DG에서 태어난 지 약 2-3주 후, 흥분성 시냅스 전달에 필수적인 수지상 가시와 같은 몇 가지 특징이 나타나기 시작한다¹⁸. Zhao et al. 척추 성장의 피크가 처음 3-4 주 동안 발생한다는 것을 보여주기 위해 정량 분석을 수행했다¹⁹. 여러 전기생리학적 생체 내 연구에 따르면 EE 하우징 조건이 3주만 지속되면 DG의 시냅스 전달에 변화가 생기고 세포 흥분성이 증가한다²⁰. 또한, BrdU 주사 후 1-4주에 농축된 환경에 노출되면 생쥐²¹의 DG 과립층에서 BrdU/NeuN 세포의 밀도가 유의하게 증가한 것으로 보고되었습니다. 이 저자들은 새로운 뉴런 수의 상당한 증가가 관찰 되었기 때문에 EE 노출 후 1 주에서 3 주 사이에 중요한 기간이 존재한다고 제안했다²¹. 인간의 성인 해마 신경 발생(AHN)에 대한 연구는 직접적인 증거가 없기 때문에 논란의 여지가 있습니다. 그러나 최근 보고서에서는 인간 성인 뇌에서 AHN의 발달 단계를 설명하여 DG에서 수천 개의 미성숙 뉴런을 식별하여 인간의 노화 동안 AHN의 중요성을 입증했습니다²². 앞서 언급한 증거에 따르면 동물 모델에서 AHN에 대한 연구는 그 어느 때보다 중요합니다(AHN에 대한 보다 심층적인 조사는 Leal-Galicia et al., 2019 리뷰¹⁵ 참조).

앞서 언급했듯이 해마는 학습 및 기억 능력의 기본 기능과 관련이 있습니다. 기억의 형성은 인코딩 (메모리 획득), 통합 (메모리 저장) 및 검색 (메모리 인식)의 세 가지 과정을 거칩니다 (메모리 인식)²³. 인간의 인식 기억은 시각적 쌍 비교 작업(²⁴)을 사용하여 테스트된다. 기억과 기억 상실증의 인간 및 동물 모델의 기본은 시각적 쌍 비교 작업이 인간에서하는 것처럼 이전에 제시된 자극^25,26을 인식하는 능력을 평가하는 행동 테스트입니다. 따라서 설치류가 이전에 제시된 자극을 인식하는 능력, 즉 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 행동 테스트 중 하나는 자발적인 새로운 객체 인식 작업 (NORT)^{입니다 23,27}. NORT 프로토콜은 획득 시험에서 10분 동안 친숙한 경기장에서 두 개의 동일한 새로운 개체로 구성됩니다. 0 -^{28 내지 48} 시간²⁹ 사이의 특정 시간 (각 프로토콜에 따라 가변적인 시간) 후에, 동물은 동일한 친숙한 물체들 중 하나, 및 하나의 새로운 물체를 포함하는 동일한 경기장으로 되돌아 간다. 동물은 친숙한 물체가 암기되면 새로운 물체를 자발적으로 탐구한다²⁶. 선호도 비율은 일반적으로 탐사 성능을 평가하는 데 사용됩니다. 전체 객체 탐사 시간을 소설 또는 친숙한 객체의 탐사 시간으로 나누어 결정됩니다. NORT는 다른 인식 메모리 테스트에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은 외부 동기 부여, 보상 또는 처벌이 필요하지 않다는 것입니다. 스트레스가 많은 조건을 생성하지 않습니다. 마지막으로, 물체를 탐색하는 행동을 불러일으키기 위해 훈련이 필요하지 않습니다(NORT에 대한 더 심층적인 조사는 ^ref.23 참조).

따라서 성인 해마 신경 발생의 효과로서 여러 데이터 양식의 동시 기록과 학습 및 기억 연구에 통합하는 것은 매우 매력적이며 해당 분야의 연구자들에게 매력적인 솔루션을 제공합니다. 본 작업은 동시 행동 비디오 추적 평가(새로운 물체 인식 작업) 및 무선 뇌파 기록과 관련된 모든 프로세스를 공개합니다. 여기에서는 전극 제조 공정, 경막외(두개골 나사) 전극 이식 수술, 환경 강화 프로토콜(해마 신경 발생 유도용), NORT 프로토콜에 따름, BTS 설정, 실시간 동시 모니터링을 위한 EEG – BTS 커플링, MATLAB 컴퓨팅 환경에서 실행되는 EEG 및 행동 데이터 분석을 검토했습니다.

모든 절차는 동물 복지 및 동물 고통 금지에 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 국립 보건 기관 및 멕시코 현지 법률에 의해 시행된 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 N°. 8023, 1978년 개정)를 따릅니다. Universidad Iberoamericana의 윤리위원회는 이 연구에서 동물 사용에 대한 실험 프로토콜을 승인했습니다.

1. 일반 설정

1. 제조 지침에 따라 컴퓨터에 행동 추적 소프트웨어를 설치합니다.
2. 카메라가 아래를 향하도록 장치 바로 위에 카메라를 장착합니다. 카메라가 컴퓨터에 연결되어 있어야 합니다.
3. 카메라에 필요한 드라이버 소프트웨어를 설치합니다(제조 지침에 따름).
4. 카메라에 줌 렌즈가 포함되어 있는 경우 카메라 디스플레이에 완벽하게 맞도록 조정하십시오.
5. 제조 소프트웨어에 따라 카메라 자동 초점(AF) 모드를 끕니다.
6. 카메라가 실시간으로 올바르게 작동하는지 확인하고 사용할 준비가 될 때까지 비디오 캡처 모드를 테스트합니다.

2. 환경 농축 프로토콜(그림 1 참조)

참고: 이 실험에는 생후 3개월 된 수컷 Wistar 쥐를 사용했으며 자연적인 암광 조건에서 유지되었습니다.

1. 투명한 아크릴 사각형 경기장 (500 x 500 x 500 mm)에 톱밥 침구를 놓습니다.
2. 설치류가 상호 작용할 수 있도록 경기장에 세 가지 종류의 장난감을 놓습니다(예: 활동 바퀴, 더블 데크, 계단 등).
3. 4개의 2인치 및 4개의 곡선형 회색 불투명 PVC 튜브를 추가합니다.
4. 동물에게 임의로 접근할 수 있는 음식 및 물 디스펜서를 제공합니다.
5. 케이지 당 3 마리의 설치류를 규칙적인 조건에서 동물 사육장 안에 두십시오.
6. 해당 프로토콜에 따라 필요한 시간 동안이 경기장에 동물을 두십시오. 이 실험에서 동물은 20일 동안 경기장 안에 있어야 합니다.
   참고: 전극 이식 수술 후 동물은 환경 강화 치료로 돌아가지 않습니다. 대신, 그들은 새로운 물체 인식 테스트가 완료 될 때까지 단일 케이지에 넣어졌습니다.

3. 전극 제조공정

1. 구리선을 약 2cm로 자르고 사포를 사용하여 양쪽 끝에서 약 0.5cm를 문지릅니다.
2. 구리선의 한쪽 끝을 작은 나사(전극)의 머리에 감고 이것이 중요한 단계이므로 단단히 고정되었는지 확인하십시오. EEG 신호의 아티팩트를 피하기 위해 두 재료 간의 올바른 접촉이 보장되어야 합니다.
3. 커넥터의 단자 팁에 다른 쪽 끝을 삽입하고 미세 집게를 사용하여 보강하여 제대로 고정되었는지 확인합니다. 이 팁은 앰프 케이블과 연결해야 합니다.
4. 멀티미터를 사용하여 팁에서 나사까지 적절한 전도도를 측정합니다. 이 프로세스는 전극 연결이 제대로 설치되었는지 확인합니다.

4. 경막외 (두개골 나사) 전극 이식 수술

참고: 20일간의 환경 강화 치료 후 동물은 아래에 설명된 절차에 따라 수술을 받게 됩니다.

1. 케타민/자일라진(90/10 mg/kg, i.p.) 칵테일을 동물에게 주사합니다.
   알림: 기도 막힘을 방지하려면 쥐가 움직이지 않을 때까지 기다렸다가 하우징 케이지에서 꺼내 동물을 평평한 표면에 놓으십시오. 선제적 진통제로 비스테로이드성 항염증제(멜록시캄 1mg/kg, s.c.)와 항생제(엔로플록사신 2.5mg/kg, p.o.)를 주사합니다.
2. 쥐가 완전히 마취되면 쥐의 머리 부분을 면도하십시오.
   알림: 수술을 계속하기 전에 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 다리 또는 꼬리 중 하나를 조심스럽게 꼬집습니다. 동물이 자극에 반응하면 몇 분 더 기다렸다가 다시 꼬집습니다. 동물이 핀치에 반응하지 않으면 다음 단계로 이동하십시오. 필요한 장비를 사용할 수 있는 경우 안전을 위해 더 쉽게 적정할 수 있으므로 가스 마취(예: 이소플루란)를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 귀 막대로 양쪽 귀를 먼저 고정하여 동물을 정위 장치에 놓습니다 (동물의 내이를 다치게하지 않도록주의하십시오). 마지막으로 앞니를 바이트 바 위에 놓고 코 바를 고정합니다.
   참고: 이 절차에 사용되는 마취는 일반적으로 저체온증과 호흡 문제를 일으키기 때문에 모든 수술을 위해 동물에게 가열 패드를 제공하십시오.
4. 클로르헥시딘 또는 요오드 기반 스크럽을 세 번 번갈아 가며 식염수 또는 알코올 헹굼을 사용하여 머리 부분을 청소합니다.
5. 리도카인을 머리 부위(0.5mL)의 피부 아래에 피하(20mg/mL)로 투여합니다.
6. 5-10분마다 각 동물의 눈에 점안액이나 식염수를 한 방울 떨어뜨려 건조하지 않도록 합니다.
7. 메스를 사용하여 앞쪽에서 뒤쪽으로 약 2cm를 절개하여 두개골의 상단 부위가 적절하게 노출되도록 합니다.
8. 불독 클램프를 사용하여 피부를 집어넣고 두개골 위에 있는 조직을 긁어냅니다.
9. 얻은 브레그마 좌표를 식별하고 기록합니다.
10. Bregma에서 시작하여 입체 Paxinos 및 Watson Atlas³⁰을 사용하여 전극이 고정 될 7 개의 점 (좌표) 각각의 위치를 찾아 표시합니다.
    참고: 이 실험에서 F3, F4 나사(Bregma에서 +2.0mm, 정중선에서 측면 2.25mm); C3, C4 나사(Bregma에서 -3.0mm, 정중선에서 측면 2.75mm); 및 P3, P4 나사 (Bregma에서 -7.0 mm, 정중선에서 측면 2.75 mm)가 설치되었습니다. 일곱 번째 나사는 지면을 기준으로 비강 뼈(NZ)의 뒤쪽에 위치했습니다( 그림 2 참조).
11. 가변 속도 드릴 도구를 사용하여 각 표시에 팁 크기 2 (길이 44.5mm)의 구멍을 만들고 두개골이 완전히 관통하지 않도록주의하십시오.
12. 전극을 구멍에 삽입하고 두개골에 조심스럽게 나사로 고정합니다.
13. 7개의 나사가 모두 적절하게 고정될 때까지 4.10단계와 4.11단계를 반복합니다.
14. 치과 용 시멘트의 첫 번째 층으로 7 개의 나사를 모두 고정하십시오. 각 전극을 커넥터에 삽입합니다. 치과 용 시멘트의 두 번째 층 (동물이 나사를 당기는 것을 방지 함)과 커넥터 바닥으로 전선을 완전히 덮으십시오. 필요한 경우 세 번째 치과용 시멘트 층으로 덮고 적절한 연결을 위해 EEG 커넥터를 깨끗하게 유지하여 EEG 장치를 적절하게 연결할 수 있도록 합니다( 그림 3 참조).
    알림: 각 쌍의 양측 나사를 배치한 후 치과용 시멘트로 고정할 수 있습니다(선택적 단계).
15. 쥐를 밤새 수술 후 관리에 두십시오. 동물을 관찰하고이 절차에 사용 된 마취가 일반적으로 저체온증과 호흡 문제를 일으키기 때문에 수술 후 1-2 시간 동안 동물에게 가열 패드를 제공하십시오.
16. 탈수를 방지하기 위해 식염수 50mL/kg/24h(유지 용량)를 피하 투여합니다. 비스테로이드성 항염증제(멜록시캄 2mg/kg, s.c.) 및 항생제(엔로플록사신 5mg/kg, p.o.) 수술 후 그리고 다음 24시간 동안 주사합니다.
17. 수술 후, 행동 테스트를 실시하기 전에 7 일 동안 완전한 회복을 위해 쥐를 단일 케이지에 보관하십시오.
18. 주기적으로 (적어도 하루에 한 번) 동물을 부드럽게 조작하여 향후 조작시 스트레스를 줄이십시오. 한 손으로 쥐를 잡고있는 동안 손가락 압력이 동물의 뒤쪽에 부드럽게 가해져 손가락을 모피를 통해 미끄러집니다. 수술 후 일주일 동안 머리 상처, 건강 상태, 일반적인 행동 및 체중을 확인하십시오.
    알림: 동물에서 질병/스트레스의 이상이나 징후가 발견되면 담당 수의사에게 알리십시오. 이 기간이 지나면 Novel 물체 인식 테스트 및 EEG 기록 기술을 수행합니다.

5. 신객체 인식 테스트(NORT)

참고: 수술 후 7일 후에 행동 검사를 진행합니다. 제시된 실험에서 모든 행동 절차는 14 h 00 min 및 16 h 00 min 사이에 수행되었으며, 이는 rat's light cycle에 해당한다.

1. 부드러운 천으로 만든 조끼(행동 테스트 중에 EEG 장치를 놓을 수 있음)를 쥐에게 놓습니다. 행동 테스트를 수행하기 전에 2-3 일 동안 습관을 허용하십시오.
2. 검은색 아크릴 정사각형 경기장(500 x 500 x 500mm)을 조명이 어두운 녹음실에 놓습니다.
3. 양면 테이프를 사용하여 경기장 바닥 중앙에 두 개의 동일한 새로운 물체를 고정합니다(동물에 의한 변위를 방지하기 위해). 물체는 서로 그리고 경기장 벽과 같은 거리에 있어야 합니다.
4. 50% 에탄올로 미리 각 물체를 철저히 청소하고 각 시험 후에 경기장 바닥을 철저히 청소하십시오(후각 신호를 피하기 위해).
   참고: 각 세션을 시작하기 최소 30분 전에 항상 동물을 사육실(동물 사육장에서 실험실로)로 옮기십시오. 녹음 세션을 마친 후 동물을 실험실에 한 시간 더 두십시오. 이는 이 테스트의 성능에 영향을 줄 수 있는 스트레스를 피하기 위한 것입니다.
5. 각 테스트를 시작하기 전에 EEG 장치를 연결하십시오. 동물을 부드럽게 구속하고 동물의 등에 부착된 EEG 키트를 사용하여 케이블을 동물 머리의 커넥터에 단단히 삽입합니다( 그림 4 참조). 한 위치만 허용됩니다.
   알림: 동물을 부드럽게 조작하면 연결 절차 중에 동물의 스트레스를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그렇지 않으면 장치나 동물이 손상될 위험이 높아집니다. USB 포트를 사용하여 장치 배터리를 완전히 사전 충전하십시오.
6. 새로운 객체 인식 테스트 단계
   1. 습관화: 연속 이틀 동안 5분 간격으로 동물을 다루고, 그 직후에 동물을 경기장에 놓고(물건 없이) 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      참고: 획득 및 기억 테스트 세션을 실행하기 전에 쥐를 조심스럽게 다루고 해당 EEG 장치에 연결했으며, 테스트를 시작하기 전에 적절하게 고정되었습니다.
   2. 획득 세션: 물체와 반대편 벽 중 하나를 향하여 경기장에 동물을 놓습니다. 동물들이 10분 동안 자유롭게 탐험할 수 있도록 합니다. 행동 추적 소프트웨어를 사용한 테스트 기록을 위해 6.13단계로 이동합니다.
      알림: EEG 장치가 쥐의 등에 부착된 조끼를 제대로 고정하는지 확인하십시오(동물의 적절한 추적을 위해). 추가 보강을 위해 마스킹 테이프를 사용하십시오.
   3. 단기 기억 테스트(SMT): 개체 중 하나를 모양, 색상 및 질감이 완전히 다른 다른 개체로 교체합니다. 획득 세션 후 2시간 후에 물체와 반대편 벽 중 하나를 마주보고 있는 경기장에 동물을 놓습니다. 동물이 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 행동 추적 소프트웨어를 사용하여 테스트 기록을 위해 6.13 단계로 이동하십시오.
   4. 장기 기억 테스트(LMT): 사용된 물체를 단기 기억 테스트와 모양, 색상 및 질감이 완전히 다른 다른 물체로 대체합니다. 획득 세션 후 24시간 후에 물체와 반대편 벽 중 하나를 마주보고 있는 경기장에 동물을 놓습니다. 동물이 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 행동 추적 소프트웨어를 사용하여 테스트 기록을 위해 6.13단계로 이동합니다.

6. 행동 추적 소프트웨어 설정

1. 행동 추적 소프트웨어를 엽니다.
2. 교육기관의 사용자 및 비밀번호를 사용하여 계정에 로그인합니다.
3. '비어 있는 새 실험' 탭을 열고 프로토콜 이름(예: 'NORT')을 선택합니다.
4. "비디오 추적 모드"를 선택합니다.
   참고: 이 실험에서 카메라는 비디오 추적을 실시간으로 스트리밍하도록 설정됩니다. 그러나 사전 녹화된 비디오를 선택하는 추가 옵션이 있습니다.
5. "장치"로 이동합니다. 주황색 사각형을 투영된 경기장의 한계로 조정하여 경기장 영역을 정의합니다. 화면의 카메라에서 투사된 경기장 내부의 개체 경계에 주황색 원을 맞춰 개체의 영역을 결정합니다.
6. 눈금자 이동 눈금자 선을 이미지의 알려진 길이(경기장)를 따라 위치로 설정합니다. 설정 패널의 "눈금자 선의 길이"옵션에 물체의 길이를 밀리미터 단위로 입력하십시오. 이 경우 경기장의 크기는 500 x 500mm입니다.
7. "추적 및 동작"으로 이동합니다. "영역"으로 계속 진행합니다. "항목 추가" 메뉴를 클릭하고 "새 영역"을 선택합니다. 경기장 영역을 선택하고 새 구역의 이름을 지정합니다(예: "필드").
8. 개체 영역에 대해 이전 단계를 반복하고 새 영역의 이름을 지정합니다(예: "개체").
9. "동물 색상"으로 이동하여 "동물이 장치 배경보다 밝습니다" 옵션을 선택합니다.
   참고: 이 실험에는 백색(Wistar) 쥐가 사용되었습니다. 그러나 이 소프트웨어에는 검은색 쥐와 점박이 쥐를 사용하는 연구원을 위한 추가 옵션이 있습니다. 두 품종의 동물 모두 동일한 실험에 사용할 수 있습니다.
10. "동물의 머리와 꼬리 추적"으로 가서 "예, 동물의 머리와 꼬리를 추적하고 싶습니다"를 선택하십시오.
11. "테스트"로 이동 | "단계"를 선택하고 "항목 추가" 메뉴에서 "새 단계"를 선택합니다. 새 단계의 이름을 "획득"으로 지정합니다. 스테이지의 지속 시간(예: 600초)을 정의합니다.
12. "단기 기억 테스트"와 "장기 기억 테스트"단계의 이전 단계를 반복하십시오.
    참고: 이 프로토콜에서는 모든 stages의 지속 시간은 동일합니다(10분).
13. "절차"로 이동하십시오. 각 단계(획득, 단기 기억 테스트 및 장기 기억 테스트)에 대해 추적할 이벤트를 정의합니다.
14. (각 동물과 함께) 테스트를 시작하십시오. 상단 메뉴 표시줄의 "테스트"로 이동하여 "테스트 추가(+)"를 선택합니다. 테스트할 동물의 번호(예: "1")를 지정합니다.
15. "기록"을 선택하고 동물과 세션의 이름을 지정합니다(예: "M1 Acq").
16. 경기장에 동물을 배치하기 전에 "재생"버튼을 한 번 클릭하십시오. "시작 대기 중"이라는 메시지가 표시됩니다.
17. 경기장에 동물을 배치 한 후 "재생"버튼을 두 번 클릭하십시오. 테스트가 자동으로 시작되고 종료됩니다.
18. 단기 기억 테스트(획득 세션 후 2시간) 및 장기 기억 테스트(획득 세션 후 24시간)에 대해 6.13-6.16단계를 반복합니다.

7. 무선 전기생리학 장치 설정

1. 모뎀을 PC 호스트에 연결하고 전원을 켭니다. PC의 다른 네트워크 장치를 끕니다. 가급적이면 등록 실에서 Bluetooth, 휴대폰, 기타 모뎀 또는 무선 핸드셋과 같은 다른 무선 통신을 무음으로 설정하십시오.
2. 부착 amp5.5단계에서 언급한 대로 쥐의 등에 liifier를 연결합니다.
3. 배터리를 연결하여 EEG 장치를 켭니다.
   알림: 장치를 연결한 후 2초 후에 EEG의 빨간색 LED ampliifier가 깜박이면 모뎀과의 통신이 활성화되었음을 나타내고 녹색 LED가 켜집니다. 통신에 성공하면 모뎀의 LED가 계속 깜박이기 시작합니다. 증폭기는 이제 모뎀에 정보를 보낼 준비가 되었습니다.
4. EEG 소프트웨어를 실행하고 제조업체 지침에 따라 설정하여 무선 EEG 획득 장치에 통합합니다.
5. "디스플레이 시작" 버튼을 누릅니다. EEG 소프트웨어는 실제 신호 수집을 표시합니다.
   참고: "Windows 작업 관리자"를 사용하여 실험 중에 정보가 누락되지 않도록 "실시간" 우선 순위 모드를 할당합니다.

8. 뇌파 검사 (EEG) 신호 기록

1. EEG 소프트웨어가 데이터를 수집하고 있는지 확인한 후 행동 추적 소프트웨어를 실행하고 실험 프로토콜을 설정하여 동물이 관찰 영역에 있고 설정이 올바르게 작동하는지 확인합니다.
2. 이 시점에서 "기록 시작" 버튼을 눌러 EEG 소프트웨어 기록을 시작합니다. 획득 신호가 실행 중인지 확인한 후 BTS에서 실험을 시작합니다.
3. 실험이 끝나면 EEG 소프트웨어로 돌아가 기록 프로세스를 중지합니다. 녹음은 "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx" 형식을 사용하여 녹음 날짜로 구성된 기본 이름을 사용하여 저장됩니다. 기본적으로 모든 기록은 EEG 소프트웨어(NeurophysData) 폴더에 저장됩니다.
4. 두 데이터 파일이 모두 생성되었는지 확인합니다. 혼동을 피하기 위해 실험 로그를 기록하거나 이름을 변경합니다.

9. 행동 과제 및 EEG 신호 동기화

1. MATLAB을 열고 명령 convert_plx2mat를 실행합니다. 이러한 기능은 브라우저 상자를 엽니 다. 변환 함수는 제조업체에서 제공하며 MATLAB의 경로에 추가해야 합니다.
2. 변환할 *.plx를 선택하고 MATLAB 명령줄에서 "Enter"를 눌러 디폴트 파라미터로 변환합니다.
3. BTS 실험 파일을 열고 "프로토콜"로 이동합니다. "결과, 보고서 및 데이터" 옵션을 클릭하고 두 개체의 모든 이벤트를 선택하고 "보고서의 시간 형식 선택"을 클릭한 다음 세 번째 옵션인 "이벤트 시간을 HH:MM:SS.sss로 실시간으로 표시 - 예: 13:20:14.791"을 선택합니다.
4. 이제 "파일"로 이동하여 "내보내기" 및 "실험을 XML로 내보내기"를 클릭하고 "테스트 날짜 및 시간"을 선택한 다음 마지막으로 "XML 만들기"를 클릭합니다.
5. "테스트 데이터 내보내기"로 이동하여 "데이터 저장"을 클릭합니다. 이벤트 시간이 포함된 .csv 파일이 생성됩니다.
6. 각 파일에 대해 9.1-9.5단계를 반복합니다. 우리의 경우 세 가지 실험은 ACQ, STM 및 LTM이었습니다.
7. EEG 및 행동 파일이 변환되면 단일 폴더에 수집합니다. 폴더에는 각각 6개의 파일, 3개의 .mat 파일 및 3개의 .csv가 있어야 합니다. 우리의 경우 파일 이름은 PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv 및 PID_03_LTM_M.csv입니다. ID는 동물의 식별 번호를 나타냅니다.
8. MATLAB을 사용하여 "procesa_sujeto.m" 함수를 열고 두 번째 줄을 동물의 ID로 조정합니다.
9. 이제 MATLAB을 해당 폴더로 이동하고 "procesa_sujeto"를 실행하여 ACQ, STM 및 LTM 단계에서 객체 인식과 관련된 거듭제곱에 대한 알파 및 베타 상대 밴드 수치를 만듭니다.
   참고: "procesa_sujeto"는 여러 신호 처리 분석을 실행/실행하는 기능입니다. 이러한 분석은 9.10 - 9.15 단계에서 다음과 같이 요약됩니다.
10. 위상 보정을 사용하여 [5-40]Hz에서 4차 버터워스 대역통과 필터로 각 EEG 신호를 필터링합니다.
11. 다음 분석 전에 신호를 육안으로 검사하고, 결함 있는 전극 배치 또는 동물 움직임에 의한 잘못된 조정으로 인해 파생된 아티팩트가 있는 채널은 추가 분석에서 제외했습니다.
12. 모션 아티팩트를 완화하기 위해 공통 평균에 대한 참조 신호.
13. EEG 신호를 분할하여 BTS에서 파생된 타임스탬프로 동기화된 4초 길이의 Epoch를 형성합니다. 목표 이벤트는 물체 경계에 대한 동물의 거리로 표시된 물체의 탐사였습니다. 이러한 이벤트는 BTS 타임스탬프에 표시되며 창의 위치를 고정하는 식별자로 사용되었습니다. 따라서 EEG 시대는 탐사가 시작되기 전 1초에서 3초 후로 구분됩니다. 이 시점에서 탐사 길이에 대한 검증은 사용되지 않았지만 향후 연구를 위해 고려 될 것입니다.
14. 1초 창 길이, 90%의 중첩, 푸리에 변환 추정 이전의 해닝 창을 사용하는 Welch의 주기도 방법을 사용하여 해당 Epoch의 스펙트럼 전력 밀도를 추정하고, 이러한 매개변수를 사용하여 1Hz의 분해능을 달성했습니다.
15. 주기도 아래 면적을 평가하여 각 대역의 파워 스펙트럼을 평가하고, 제시된 값은 상대 에너지에 해당하며, 이는 각 EEG 대역의 에너지를 Epoch의 총 에너지로 나눈 값을 의미합니다. 이 절차는 또한 EEG 신호의 아티팩트로 인한 잘못된 추정을 줄입니다.

상술한 방법들은 환경농축 처리 후 EEG와 쥐의 활동을 동시에 기록하기 위해 적용되었다. 생후 3개월 된 수컷 Wistar 쥐를 20일 동안 중기 환경 농축 치료 프로토콜을 받았고, NZ에 위치한 일곱 번째 전극을 기준으로 전두엽, 중앙 및 정수리 부위에 쌍을 이루는 6개의 두개골 나사 전극을 고정하기 위해 수술을 받았습니다. 동물들은 자연적인 암흑광 조건에서 유지되었으며, 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다. 이 작업은 동시 라이브 녹음을 위한 EEG 시스템과 행동 추적 소프트웨어 간의 통합을 보여줍니다. 우리는 치료의 효과를 비교하는 척하지 않고 장비의 장점만을 예시하기 때문에 EE 프로토콜에 따라 처리된 동물만 사용했습니다. 사용된 20일 환경 강화 하우징 프로토콜이 성인 신경 발생을 자극한다는 증거로서, 우리는 EE에 속한 동물과 우리 실험실의 미공개 데이터에서 표준 조건으로 수용된 동물의 BrdU 양성 세포 수 데이터를 제시합니다. 생후 3개월 된 수컷 Wistar 쥐를 사용하였다. 이들은 서로 12시간 간격으로 BrdU를 3회 주사하였다. 동물을 마취하고(펜토바르비탈(50mg/kg, ip) 경심 관류로 안락사시켰습니다( 그림 5 참조). EEG 장치에 부착된 조끼가 동물의 움직임을 제한하지 않도록 하기 위해 개방 필드 테스트(OFT)를 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 장비(조끼 및 EEG 증폭기)를 착용한 상태에서 수술을 받았고 다른 그룹은 하드웨어를 착용하지 않고 손상되지 않았습니다. 우리는 10 분의 테스트 ( 그림 5 참조)에서 동물이 이동 한 거리에서 큰 차이를 발견하지 못했습니다. 일반적인 NORT 프로토콜은 두 개체를 표시하고 그 중 하나를 새 개체로 대체하는 것으로 구성됩니다. 행동 추적 소프트웨어는 탐사 시간을 모니터링했습니다.

행동 추적 소프트웨어는 주요 성능 매개 변수를 평가하기 위해 동물 그룹을 기록했습니다. 따라서 탐색 성능을 평가하기 위해 세 가지 매개 변수를 사용했습니다. 선호도 비율은 동물의 머리가 각 개체에서 보낸 총 시간을 보고하는 개체 영역에서 보낸 동물의 머리 시간을 사용하여 계산되었습니다. 또한 물체를 향해 이동하는 데 소요된 시간에 대한 선호도 비율을 계산하여 각 물체 영역을 향해 이동하는 모든 동물에 소요된 총 시간을 보여줍니다. 또한 각 개체를 방문 할 때마다 소요 된 시간이 계산되었습니다. 그림 6 은 위에서 언급한 세 가지 매개 변수 결과를 보여줍니다. 획득 시험에서 평가된 세 가지 매개변수에서 개체 간에 차이가 없었습니다: 세 번의 시도에 대한 개체 영역에서의 헤드 시간, 세 번의 시도에 대한 개체로 이동하는 시간, 각 개체의 방문당 시간. STM 시험에는 차이가 없었다. 한편, LTM 시험에서는 새로운 물체에 대해 상당히 높은 탐사 선호 비율이 나타났습니다. 또한 LTM 시험에서 방문당 소요 시간(패널 C)에서 새로운 대상에 대한 선호도도 볼 수 있었습니다. 비디오 1 은 실험에서 기록된 쥐의 대표적인 예를 보여주고, 비디오 2 는 동시 뇌파 및 행동 기록의 대표적인 예를 보여줍니다.

컴퓨터 시계를 사용하여 기록된 행동 추적 및 EEG 소프트웨어 기록으로 추적된 시간 이벤트를 일치시킬 수 있었습니다. 그림 7 과 그림 8 은 알파 및 베타 밴드에 대한 EEG 상대 전력의 변화를 보여줍니다. 이는 운동 제어, 집중력 및 기억력과 관련이 있으며, 이는 탐사가 이러한 기능과 관련이 있음을 시사합니다. 동물 3의 결과는 알파 전력이 ACQ 및 LTM과 관련하여 STM에서 감소하는 경향이 있음을 보여주며, 이는 탐색 또는 메모리 검색과 관련된 비동기화를 시사합니다. 객체 인식(처리된 epoch)의 수는 낮았다. 이 시점에서, 통계적 테스트가 그러한 차이가 실제인지 또는 인공물이 그러한 실험 조건을 생성 할 수 있는지를 검증하는 것은 불가능합니다. 그럼에도 불구하고 에포크 세분화, 라벨링 및 분석은 동물의 동시 마킹 이벤트와 향후 연구 프로젝트를 위해 생성된 EEG 결과의 타임라인에 의해 가능해졌습니다. 이러한 시스템을 결합하면 동물 실험 목적에서 중요한 문제가 된 수동 마킹 프로세스에 의한 잘못된 이벤트 식별을 방지할 수 있습니다. BTS와 전기생리학적(EP) 활성의 조합은 동물 행동과 정확하게 연관될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 실험 조건에서는 모션 아티팩트를 제거하고 실험 설정을 효과적으로 개선하기 위해 고급 신호 처리 기술을 사용해야 합니다.

그림 1: EE(Enriched Environment) 조건 케이지의 예. 주택에는 장난감과 튜브가 제공되었는데, 동물들은 새롭고 복잡하지만 생물학적 관련성은 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 쥐 두개골에서 경막외 전극의 위치. 나사는 헤드셋의 앵커와 전극으로 동시에 사용되었습니다. F = 정면; C = 전두엽; P = 정수리; 3 = 왼쪽; 4 = 오른쪽; NZ = 지상 기준으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 경막외(두개골 나사) 전극 이식 수술의 대표 이미지. 수술의 여러 단계에서 쥐에 이식된 두개내 전극 나사를 보여주는 이미지. 이 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 따르는지 확인하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 실험 설정과 함께 쥐의 대표 이미지. 쥐는 NORT 프로토콜에 사용되는 경기장 내부에서 배터리가 내장된 EEG 장치에 부착된 조끼를 착용하도록 만들어졌습니다. 이미지는 헤드셋과 머리의 쥐에 설치된 케이블 커넥터를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: EE 프로토콜에 의한 운동 능력 및 성인 신경 발생 자극의 증거. (A) OFT(Open Field Test)에서 10분 동안의 동물 활동의 대표 이미지와 장비/수술을 착용한 동물과 장비가 없는 동물/수술을 하지 않은 동물의 평균 거리. (B-E) EE 및 표준 하우징 그룹에 대한 BrdU 표지 셀(강렬한 어둠)이 있는 대표적인 DG 섹션. 패널 B와 D는 DG의 낮은 배율을 보여주고, 패널 C와 E는 더 높은 배율의 박스 영역을 보여줍니다. 패널 B 및 C는 EE 하우징 그룹의 조직이고, 패널 D 및 E는 표준 하우징 그룹의 조직입니다. 삽입물은 두 그룹에서 레이블이 지정된 셀의 평균 수를 보여줍니다. ML - 분자 층; GCL – 과립 세포층; SGZ – 세분화 된 영역; 화살표 - BrdU+ 세포. 그래프는 SEM± 평균을 보여줍니다. T-student 테스트는 그룹을 비교하는 데 사용되었습니다. * p≤0.05. Open Field Test에서 그룹 간에 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: NORT 평가의 탐색 성능. (A) 세 번의 시도에 대한 개체 영역에서의 헤드 타임. (B) 세 번의 시도를 위해 물체를 향해 이동하는 시간. (C) 각 개체의 방문당 시간. 그래프는 SEM± 평균을 보여줍니다. 양방향 반복 측정 ANOVA와 Sidak의 다중 비교 테스트가 모든 매개변수에 사용되었습니다. * p≤0.05, ** 각 시험의 개체 사이에 p≤0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 탐사와 관련된 알파 EEG 대역 전력의 변화. 이 그림은 동물이 물체 탐사를 시작한 후 30초에서 2.5초까지 상대적 알파 파워의 변화를 보여줍니다. 6개의 그래프는 정면, 중앙 및 정수리 전극(위에서 아래로)과 왼쪽 및 오른쪽에 해당합니다. 상자 그림은 객체의 각 조건 조합("Familiar" 및 "Novel")과 단계("ACQ", "STM" 및 "LTM")에 대한 이러한 시계열의 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 탐사와 관련된 베타 EEG 대역 전력의 변화. 이 그림은 동물이 물체 탐사를 시작한 후 30초에서 2.5초로 상대적인 베타 전력의 변화를 보여줍니다. 6개의 그래프는 정면, 중앙 및 정수리 전극(위에서 아래로)과 왼쪽 및 오른쪽에 해당합니다. 상자 그림은 객체의 각 조건 조합("Familiar" 및 "Novel")과 단계("ACQ", "STM" 및 "LTM")에 대한 이러한 시계열의 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 1: 실험에 기록된 쥐를 보여주는 대표적인 영상. 쥐는 NORT 프로토콜에 사용된 경기장 안에 있었습니다. 쥐는 배터리가 내장된 EEG 장치에 부착된 조끼를 입고 있었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

영상 2: EEG와 행동의 동시 기록을 보여주는 대표 영상. EEG 신호는 비디오의 오른쪽에 표시되고 행동 테스트(NORT)는 비디오의 오른쪽에 표시되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

실비아 오르테가-마르티네즈 박사는 이 기사에 대한 제작 및 공개 액세스를 제공하고 후원한 회사인 Stoelting Co.의 직원으로 일하고 있습니다.