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방법 논문

중요 사지 이혈증을 가진 Angioplasty 처리한 환자에 있는 현지 순환 단핵 전구 세포를 사용하여 절단을 예측합니다

3K 조회수

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DOI:

10.3791/61503

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2020년 9월 22일

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1Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory, Clinical Research Department, Division of Biomedical Research, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, 2Vascular Surgery and Angiology Department, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, 3Regenerative Medicine and Tissue Engineering Laboratory; Coordination of Research, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE

이 논문에서

요약

낮은 사지 절단은 중요한 사지 허혈 (CLI)에 있는 방해한 선박의 혈관 성형술 후에조차 생길 수 있습니다. 단핵 전구 세포 (MpC)는 혈관 수리를 반영합니다. 본 프로토콜은 혈관 성형술에 가까운 순환에서 MpC의 정량화, 내피 기능 장애및 낮은 사지 절단의 예측과의 관계를 설명합니다.

초록

중요한 사지 허혈 (CLI)은 말초 동맥 질환의 고급 단계를 나타냅니다. 혈관 성형술은 하반신에 혈류를 향상시킵니다; 그러나 일부 환자는 팔다리 절단으로 돌이킬 수 없이 진행됩니다. 혈관 손상의 정도와 혈관 수리 메커니즘은 혈관 성형술 후 결과에 영향을 미치는 요인입니다. 단핵 전구 세포 (MpC)는 혈관 손상을 반사하는 능력으로 혈관 손상 및 수리에 반응합니다. 본 프로토콜은 혈관 성형술 부위에 가까운 혈관으로부터 혈액 순환에서 얻은 MpC의 정량화뿐만 아니라 내피 기능 장애와의 관계 및 CLI 환자의 혈관 성형술 후 다음 30 일 동안 사지 절단을위한 예측 능력을 설명합니다.

서론

말초 동맥 질환(PAD)은 혈액 공급1의한계를 가진 만성 및 진행성 혈관 방해를 특징으로 한다. 전 세계적으로, 하반신의 PAD는 노인 인구의 약 10%에 영향을 미치고, 그러한 경우의 최대 7%는 사지 절단2,3에제출된다.

중요 사지 허혈 (CLI)는 PAD1의가장 심각한 프리젠 테이션을 나타냅니다. 환자는 일반적으로 폐색동맥에 기인하는 휴식, 궤양, 또는 회지에서 고통을 경험합니다; 임상 예후는 불리하고 1 년 동안 사지 절단 및 사망률의 30 % 위험에 의해 표시되는 동안3,4,5.

혈관 성형술은 CLI환자에서 하반신에 혈류를 회복할 수 있는 최소 침습성 혈관 내 시술이다. 그러나, 몇몇 환자는 혈관 성형술 치료1,5후에조차, 필연적으로 중요한 사지 절단을 요구할 것입니다 . 혈관 성형술 후 불리한 결과의 조기 식별은 매우 귀중하다, 치료 집행의 가능성으로 인해.

전통적인 위험 요소는 혈관 성형술 6을 겪고 있는 CLI를 가진 환자에 있는 중요한 사지 절단을 위한 제한적인 예측 능력을 제공할 수있습니다. 병리학 지향 바이오마커는 잠재적인 임상 응용을 가진 새로운 방법을 나타내며, 이는 혈관 손상과 관련된 질병에 특히 유용할 수 있다7. 요즘, 죽상 경화성 플라크의 사이트에 내피 수리 특성을 소유 하는 세포 인구의 참여, 점점 인식 되고있다8,9.

단핵 전구 세포 (MpC)는 골수에서 파생되고 혈관 재생 능력을 가진 줄기 세포의 구조적 및 기능적 특성을 소유하고 있습니다. MPC의 증식 능력으로 인해 혈관 준수를 연장, 마이그레이션 및 표시; 이들 세포는 허혈10,11,12에대한 응답으로 내피 수리를 반영하는 좋은 후보가 되었다. 또한, 혈관 손상의 근본적인 메커니즘에 대한 지속적인 관심은 혈관 손상을 반영하고7,13,14를수리하는것으로 간주되기 때문에 국소 발생 바이오마커의 예후 역할을 탐구하는 동기를 부여하고 있다.

본 연구의 목적은 혈관 성형술을 겪고 있는 CLI를 가진 환자에 있는 혈관 방해에 가깝게 순환하는 MpC의 양을 결정하는 방법을 기술하는 것입니다; 그리고 내피 기능 장애 및 사지 절단의 지표와 MpC 사이의 관계를 평가하는 방법.

comorbidities 및 본질적인 혈관 특징에 근거를 둔 예후와 비교된, 현지 MPC의 양은 내피 기능 장애 및 사지 절단에 관하여 임상 결과를 예측하는 특정 능력을 보여줍니다. 일관되게, 몇몇 연구 결과는 PAD15,16를가진 환자의 평가 도중 유사한 biomarkers의 예후 역할을 기술했습니다.

이전 결과7에기초하여, 여기에 설명된 방법은 하반신 및 관상 동맥 허혈, 뇌졸중, 혈관염, 정맥 혈전증 및 혈관 손상 및 수리와 관련된 다른 것과 같은 여러 임상 환경에서 불리한 혈관 결과의 위험에 처한 인구의 조기 식별에 유용할 수 있다.

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프로토콜

Centro Médico Nacional "20 de Noviembre"ISSSTE의 기관 연구 윤리 위원회는 이 예비 프로토콜을 승인했으며, 등록된 모든 환자는 서면 동의를 제공했습니다.

1. 하반신, 혈액 샘플링 및 풍선 혈관 성형술의 혈관 블록 평가

참고: 이 실험에 사용된 연구 견본은 20명의 당뇨병 환자, 나이 68 세 및 20의 10의 남성이었습니다 구성되었습니다. 샘플의 절반은 흡연자였고 가장 널리 퍼진 공동 이환율은 타입-2 당뇨병, 전신 동맥 고혈압 및/또는 이상지질혈증이었습니다. 이 샘플은 연령, 성별 및 공동 이환율을 위해 표준화되기 위한 것이었습니다. MPC와 CLI 사이의 관계에 대한 임상 인구 통계학적 영향으로 인해 가능한 편견을 배제할 수 없습니다.

  1. Rutherford분류에 따라 사지 허혈의 임상 심각도 평가 13 (보충 표 1참조).
  2. 낮은 사지 혈관 조영술, 혈액 샘플링 및 풍선 혈관 성형술을 수행합니다.
    1. 수술 전에 항응고제와 마취제를 사용하십시오.
    2. 선택된 사타구니 부위에 18G 바늘을 혈관에 넣습니다.
    3. 소개자를 배치하고 유연한 가이드 와이어를 진행합니다. 그런 다음 초기 가이드가 6 Fr 소개자의 경우 추가로 변경됩니다.
    4. 항성 궤적 및 혈관 차단 부위를 식별하기 위해 형광 가이드에서 대조 미디어 또는 CO2의 정기적인 주입을사용(도 1).
      참고: 콘트라스트 미디어 40cc를 사용하여 1:1을 0.9% 식염수로 희석하거나, 12psi의 압력으로 촬영당 10~20mL에서CO2를 사용합니다.
    5. 0.014 Fr 내비게이션 가이드 와이어 2개와 0.014 Fr 지원 가이드 와이어 2대를 선박에 도입하여 차단된 사이트까지 진행합니다.
      참고: 2개의 0.014 Fr 가이드 와이어(길이 260cm)가 내비게이션에 사용되며, 단일 시술 중에 0.014 Fr 가이드 와이어 2개(길이 260cm)가 지원됩니다.
    6. 5 개의 Fr 및 3 Fr 카테터를 순차적으로 소개하고 가장 가까운 부위에서 혈관 방해에 이르기까지 10 mL의 혈액을 수집합니다. 얼음에 혈액 샘플을 유지합니다.
      참고: 카테터 크기는 5 Fr 및 3 Fr일 수 있으며 시술 중에 변경됩니다.
    7. 가이드 와이어를 다시 진행합니다. 그런 다음 카테터 끝에 팽창식 풍선이 들어있는 혈관 성형술 풍선 카테터를 소개합니다. 혈관 성형술 풍선 카테터를 진행하고 병변 부위에 풍선을 바로 놓습니다. 혈관 벽에 있는 블로킹 플라크에 풍선을 팽창시켜 혈관 성형술을 수행합니다. 혈류 회복을 확인합니다.
      참고: 스텐트는 절차 후 동맥을 열어 두는 데 도움이 되는 차단된 영역에 배치될 수 있습니다.
    8. 카테터를 소개하고 혈관 블록에 가장 가까운 사이트까지 진행합니다. 혈관 성형술 후 30 분 간격으로 혈액 10 mL을 수집합니다. 얼음에 혈액 샘플을 유지합니다.
      참고: 혈관 성형술 전후의 혈액 샘플 수집은 혈관 성형술의 영향을 MpC 수에 대한 영향을 더 평가하는 것이 좋습니다.
    9. 형광 유도에 따라 모든 와이어를 제거합니다.
    10. 12시간마다 1 mg/kg 피하, 아스피린 100 mg, 스타틴 및 진통에서 enoxaparin을 이용한 항응고 요법을 포함한 수술 후 치료 절차를 제공합니다. 24 시간 동안 혈관 천자의 부위에서 압축하십시오.

2. 순환 하는 단일 핵 전조 세포의 정량화 (MpC)(그림 2)

  1. 신선한 15mL 원문 튜브에, 수집된 혈액의 6mL를 전송하고 PBS로 1:1 (v/v)를 희석한다.
    참고: 수집에서 1시간 이내에 혈액을 처리합니다.
  2. 밀도 그라데이션 분리를 준비하여 밀도 그라데이션 배지의 2mL를 각각 3개의 테스트 튜브에 추가하여 준비합니다. 그런 다음 희석된 혈액의 3개의 동일한 부피 알리쿼트를 각 시험관에 추가합니다.
    참고: 테스트 튜브 최대 용량의 3/4을 초과하지 마십시오.
  3. 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 1,800 x g에서 원심분리기. 파이펫을 사용하여 링으로 존재하는 인터페이스 레이어를 수집하고 새 튜브로 옮습니다. PBS 2mL을 추가하고 4 °C에서 6 분 동안 1,800 x g에서 회전하십시오. 이 MpC를 포함으로 펠릿을 저장합니다.
  4. 2.3단계에서 설명한 바와 같이 PBS로 MPC를 함유한 펠릿을 원심분리에 의해 세척한다. 각 세척에 신선한 PBS를 사용하고 4 °C에서 2 분 동안 1,800 x g에서 회전하십시오. 6회 동안 프로세스를 반복합니다.
  5. 마지막 세척 후, 세포 펠릿을 다시 중단 하는 PBS의 1 mL를 사용 하 여. 0.4% 트라이판 블루, 1:1 (v/v)의 20 μL로 셀 서스펜션의 20 μL을 희석시. 혈류계 및 광 현미경을 사용하여 세포 계수에 이 세포 현탁액의 10 μL을 사용하십시오.
  6. Aliquot 1 x 106 MpC이전에 라벨이 부착된 5mL 흐름 세포측정튜브.
    참고: 해당 동종 타입 일치 제어 항체를 준비합니다.
  7. 4°C에서 6분 동안 1,800 x g의 튜브원심분리기. 상체를 속이고 폐기하십시오.
  8. 항체 인큐베이션 용액의 100 μL에서 1차 항체를 희석시키고 [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] 튜브에 첨가한다. 10 s에 대해 다시 중단하고 어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
    참고: 본 프로토콜에 사용된 1차 항체의 최종 농도는 CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50이었다. 프로토콜은 PBS에서 림프구를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 4°C에서 최대 24시간까지 시료를 저장함으로써 이 단계에서 중지될 수 있다.
  9. 원심분리기는 4°C에서 2분 동안 1,800 x g에서 상류체를 폐기하고 열판기를 폐기합니다. 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM의 500 μL에서 재차프됩니다.
  10. 유동 세포 분석 수행.
    1. 등류형 대조항체로 배경을 설정합니다. 그런 다음, FSC/SSC 플롯에서 셀룰러 파편, 잔류 과립구 및 기타 입자를 배제하려고 림프구 확산을 선택합니다. 이러한 분포는 100%로 간주됩니다.
      참고: 림프구는 일반적으로 플롯의 왼쪽 아래 지역에 퍼집니다.
    2. CD45+ 및 CD34+세포의 높은 수를 포함하는 일반적인 면역 페노타입게이트를 사용합니다. 그런 다음 이전에 CD45+CD34+및 KDR (VEGFR-2)+CD133 + 또는 CD184+ 를 추가 한 게이트를 사용하여 이중 양성 면역 페노타입을선택합니다. 특정 셀 표면 마커에 의해 MpC 하위 집단을 식별합니다. 게이트된 이벤트의 백분율로 보고합니다.
  11. MpC의 주요 하위 집단을 식별합니다. 본 연구에서 분석된 면역페노타입은 CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ CD44+KDR+CD1847,17.
    참고: 이러한 세포 표면 마커는 연구를 위해 사용되었습니다: CD45 (림프구), CD34 (내피 및 / 또는 혈관 세포), KDR (VEGFR-2) (내피 세포의 막 마커), CD133 (내피 전구 세포) 및 CD184 (헤마포에이성 줄기 세포) 및 CD184 (헤마포키세포) 및 CD184 (헤마포피 세포) 및 내피 세포.

3. 내피 기능 및 혈역학 테스트 (FMD)의 수정과 MpC의 관계

  1. 유동 매개 팽창(FMD), 사전 및 후 혈관 성형술을 결정합니다.
    1. 혈관 선형 트랜스듀서를 사용하여 상반동맥의 직경을 측정합니다.
    2. 팔뚝에 있는 측정 부위 위에 스피그마노미터의 커프를 놓고 수축기 혈압 을 5분 이상 위에 50mmHg로 부풀림합니다.
    3. 다음 60s 내에서 상반신 동맥의 직경을 다시 결정합니다. 아래 방정식을 사용하여 FMD를 추정합니다.
      참고: 방정식(%) = (과도 허혈 후 최대 직경 - 기저 직경) × 100/기저 직경을 사용하여 팽창 정도를 계산합니다.
  2. MC 수를 기준 FMD 값과 FMD의 혈관 성형술 후 델타와 상호 연관시지정합니다.

4. 사지 절단을위한 MpC의 예후 능력

  1. 풍선 혈관 성형술 및 환자 퇴원 후 정기적인 의료 약속을 예약하여 낮은 사지로의 혈류의 질을 평가합니다.
  2. 혈관 성형술 후 2 주에 사지 허혈의 임상 심각도 평가. 러더포드 분류 13에 따르면 휴식 통증, 낮은 허혈 및 기능성 발 보존 을 평가하는평가합니다.
  3. 사지 허혈의 임상 심각도 비교, 기준선 대 후속에서. 불리한 결과로 인해 주요 절단이 필요한 경우를 식별합니다.
  4. 낮은 사지의 주요 절단을 요구하는 환자의 비율과 MpC의 수를 상관.

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결과

혈관 성형술을 위해 주소가 있는 사이트에서 막힌 동맥에서 혈액 샘플은 20명의 당뇨병 환자에서 수집되었으며, 68세와 20명 중 10명이 남성이었습니다. 표본 인구의 절반은 흡연자였습니다. 혈관 병변은 주로 러더포드 급 VI로 득점되었다; 반면 환자는 타입-2 당뇨병 의 더 높은 보급을 보여주었습니다 (100%), 고혈압 (70%) 및 이상지질혈증 (55%).

하반신 혈관 성형술 후 30 일 임상 후속 이 수행되었다. 혈관 성형술 후 기준선 또는 역학에서 MPC 하위 집단의 백분율은 FMD에 의해 평가된 내피 기능 장애의 정도와 상관관계(Spearman 분석)했다; 및 MPC의 기준선 수는 혈관 성형술 (U-Mann Whitney) 후에 사지 절단을 겪고 있거나 하지 않는 환자 사이에서 비교되었습니다. 연구 결과는 기준형 MPC 하위 인구 CD45+CD34+KDR+ FMD와 부정적으로 상관 관계가 있음을 보여주었습니다

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토론

혈관 블록의 정확한 부위에서 혈액 수집은 기술적 인 어려움을 나타낼 수 있습니다; 따라서, 우리는 혈관 블록에 근접하여 혈액 수집을 수행했습니다. 마찬가지로 혈관 플라크에 가까운 MpC의 양은 매우 역동적인 것으로 보이며 혈관 성형술 전후의 변형을 생성할 수 있습니다. 우리의 관측에 따르면, 그들은 혈관 손상 및 수리 내에서 발생하는 여러 병생리학적 과정을 반영 할 수 있기 때문에, MPC의 수에 기준 선점 및 30 분 후 혈관 성형술 변화를 평가하는 것이 좋습니다.

CFC 판정을 위한 혈액 샘플 처리는 처음 3시간 이내에 수행되는 것이 좋습니다. 따라서, 적당한 조직 계획, 그리고 조차 이전 시뮬레이션 사례는, 통기학 혈관 수술 팀과 실험실 연구원 사이에서 설치될 수 있습니다. MpC 격리는 신중하게 수행해야하며, 특히 혈액 샘플을 밀도 그라데이션으로 탈취하고 MpC를 포함하는 펠릿의 세체로 분해해야 합니다. 우리 그룹은 세포 측정 관으로 세포를 전송하는 데 사용, 기본 항체를...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 프로젝트 ID 356.2015에 대한 기관 프로그램 E015의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BSARoche10735086001소 혈청 알부민(BSA)을 완충제, 안정제, 표준 및 혼합용입니다.
캘리브레이션 비드Miltenyi Biotec / MACS# 130-093-607MACQuant 캘리브레이션 비드는 0.05 % 아지드 나트륨을 함유 한 수용액으로 공급됩니다. 최대 100 회 테스트를위한 3.5 ml
CD133 / 1 (AC133) -PEMilteny Biotec / MACS# 130-080-801에서 R-Phycoerythrin과 결합 된 항체
단클론, 동형 재조합 인간 IgG1, 공액
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APCMiltenyi Biotec / MACS#130-093-601PBS/EDTA 완충액
CD34-FITCMiltenyi Biotec / MACS#130-081-001단클론 항체 클론 AC136은 CD34
CD45- VioBlueMiltenyi Biotec / MACS#130-092-880의 클래스 III 에피토프를 확인합니다.단클론 CD45 항체, human conjugated
Conical TubesThermo SCIENTIFIC#33965115ml 원뿔형 원심분리기 튜브
FALCON Corning Brand#3520525 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브.12x75 스타일. 메 마른.
EDTABIO-RAD#161-0729중금속, (Pb로서) < 10ppm, Fe< 0.01%, 그대로< 1ppm, 불용성< 0.005%
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LymphoprepStemcell Technologies01-63-12-002-A멸균 및 내독소의 존재 여부를 확인했습니다. 밀도 : 1.077± 0.001g/mL
파라포름알데히드SIGMA-ALDRICH생물학적 시료 고정, (분말, 95%)
피펫 이송 1,3mLCRM GlobePF1016, PF1015이송 피펫은 더 높은 정확도로 액체 이송을 용이하게 하는 도구입니다.
시험관KIMBLE CHASE45060 13100내열 시험관. 크기/캡 13 x 100 mm
PBS / EDTA 완충액 CD184 (CXCR4) -PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS # 130-103-798#SZBF0920V

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