이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.
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이 논문에서
요약
초록
야생 동물의 보존 프로그램에서 gamete 뱅킹은 귀중한 개인과 희귀 종의 유전 자원을 보호하고 생물 다양성 보존을 촉진하는 데 매우 중요합니다. 고양이에서, 대부분의 종은 멸종 위협, 국내 품종은 세균 은행 프로토콜의 효율성을 높이기 위해 모델로 사용된다. 난염 극저온 보존 기술 중, 유리화는 인간과 수의학 지원 생식에서 점점 더 인기가 있습니다. 인간 난모세포와 배아를 위해 처음 개발된 극저온 상체화는 고양이 난모세포에 적합하다는 것을 입증했습니다. 이 방법은 여러 샘플을 처리해야 할 때 유용할 수 있는 현장 조건의 타당성 및 절차 속도와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 그러나 효율성은 작업자의 기술에 크게 의존하며, 실험실 간 표준화와 인력 교육이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소 수집에서 온난화에 이르기까지 단계별 필드 친화적 인 프로토콜에 의해 단계적으로 상업적 지원에 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화를 설명합니다. 프로토콜에 따라 온난화시 난낭 무결성 및 생존 가능성 보존(90%까지 높음) 온난화 후 성숙과 배아 발달 결과에 개선을 위한 여지가 여전히 남아 있지만, 예상될 수 있습니다.
서론
냉동 보존은 보조 재생 기술 (ARTs)의 핵심 단계가되었습니다. 인간에서는, 그것은 의학 또는 개인적인 이유로 부모의 불임 또는 연기의 보존을 허용합니다. 동물에서는 계획된 짝짓기, 특히 농장 동물과 애완 동물에서 거리와 시간을 극복하거나 특히 야생 멸종 위기에 처한 종의 보존 프로그램에서 귀중한 과목의 유전 물질을 보존할 필요가 있습니다. Gamete 냉동 보존은 사육할 개인이 아직 선택되지 않았거나 배아 동결과 관련된 윤리적 문제를 피하기 위해 선택되지 않았을 때, 특히 인간 의학1에서최선의 선택입니다. 정자는 해동 후 비교적 보존하고 만족스러운 결과를 제공하기 쉽지만, 구조적인 특징으로 인해 난모세포는 보관하기가 더 복잡할 수 있습니다. 실제로, 낮은 표면/부피 비뿐만 아니라 우플라즈마를 둘러싼 조나 펠루치다의 존재는 셀2를가로지르는 극저온 보호제와 물의 이동을 제한한다. 또한, 골뚜껑을 포함한 국산 동물에서는 지질이 풍부한 세포질이 특징이며, 이는 냉동 보존3에더 민감하게 반응할 것으로 생각된다.
대부분의 고양이는 위협을 받고 있으며, 국내 고양이는 일상적인 ovariectomy에서 생식샘의 가용성 덕분에 ....
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프로토콜
이에 따라 묘사된 절차는 고양이 난소가 수의장에서 주인이 요청한 일상적인 혈관 절제술 또는 혈관 절제술의 부산물로서 수집되었기 때문에 윤리적 승인을 받지 못했습니다.
1. 오사이클 컬렉션
- 실험을 시작하기 전에 난소 및 난소 수집을 위한 솔루션을 준비합니다. 항생제와 항마이코틱스(페니실린 G 나트륨 100 IU/mL, 연쇄상 구균 황산염 0.1 mg/mL, 암포테린 비의 0.25 μg/mL)의 혼합물로 인산염 완충식식염(PBS)으로 난소 수집 용액을 준비한다. 페니실린 G 나트륨 100 IU/mL, 연쇄상 구균 황산염 0.1 mg/mL, 0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA)을 갖춘 PBS를 갖춘 난낭수 수집 솔루션(예: PBS/PVA)을 준비합니다.
- 난소 및 난소 수집용 솔루션을 4°C에서 사용할 때까지 보관하십시오.
- 퀸즈의 지불 당일, 샘플을 처리하기 몇 시간 전에 난소 및 난소 수집 솔루션의 일부를 취하고 실온 (RT; 25 ± 2 °C)에서 따뜻하게하십시오.
- 샘플이 실험실에 도착하면 난소를 주변 결합 조직과 oviduct에서 분리하고 페트리 접시에 신선한 난소 수집 매체로 세척합니다.
- 각 여왕에 대해 35mm 페트리 접시를 RT PBS/PVA ....
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결과
현재 프로토콜(도 1 및 보충도1)에 따라 고양이 의진동및 온난화에 따라 대부분의 게임테가 살아남습니다. 생체화 후, 다른 기술 중에서도 생체내성(22)으로 광학 현미경에서 또는 중요한 얼룩을 사용하여 생존성을 평가할 수 있다. 후자 중 하나는 형광 희석제 /propidium 요오드 (FDA/PI), 실행 가능한의 식별을 허용 (밝은 녹색 형광) 및 죽은 세포 (적색 형광). 도 2는 온난화 직후 FDA/PI로 염색된 유리화된 온난 고양이 COC의 대표적인 그림을 보여줍니다. 시험신도 후 생존의 비율을 보여주는 실험에서 얻은 데이터는 체외성숙(17) 또는 체외 배아생산(16)을위한 난모세포의 온난화 후 데이터를 묘사한 표 1에보고된다. .......
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토론
오키테 냉동 보존은 특히 펠리대 가족과 같이 많은 종들이 멸종 위기에 처한 택시에서 중요한 세균 보존 기술입니다. 이 원고에서는 미숙한 고양이 난모세포의 유리화를 위한 간단하고 현장 친화적인 프로토콜이 제시되었습니다. 실험실에서 만든 미디어, 최소 볼륨 바이트화 지원 및 훈련 된 인력은이 방법의 성공을위한 핵심 요소이며, 이는 실행 가능한 난모세포를 일관되고 반복적으로 얻을 수 있습니다, 여기에보고 된 대표적인 결과에 의해 표시된 바와 같이.
미디어 준비부터 최상의 결과를 보장하기 위해 프로토콜을 정확하게 따라야 하지만 운영자의 기술이 주요 문제입니다. 미디어는 유리화 절차의 당일을 준비해야 하며, 가능하지 않은 경우 전날 준비하여 4°C로 보관해야 한다. 어쨌든, 샘플 처리 전에, 충분한 시간을 남겨두어야 하여 솔루션이 RT까지 예열될 수 있도록 충분한 시간을 남겨두어야 합니다. 오사이클 컬렉션 및 COC 선택은 모든 ARTs 실험실에서 일상적으로 수행하는 빠르고 간단한 절차입.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 부분적으로 EVSSAR에 의해 지원되었다 (작은 동물 재생을위한 유럽 수의학 협회) 그랜트 2016 및 Università degli Studi 디 밀라노, 피아노 디 소스테그노 알라 Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A)에 의해 지원되었다. 또한 마리아조르지아 모셀리 박사가 이 실험에 기여한 것에 대해 감사드리며, 이미지 수집에 기여하고 자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| 자동 피펫 및 팁 | / | / | 피펫 20, 100, 240 및 300 & 마이크로에 필요; L |
| 수술용 메스 | / | / | 크기 10은 일반적으로 괜찮습니다 |
| 분젠 부리 | / | / | / |
| 클램프 | / | 난소 격리를 위한 작은 것(모기 클램프), 액체 질소에서 작동하는 더 큰 것(클레머 클램프) | |
| Cryotop | Kitazato(유통업체: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | 유통업체 및 카탈로그 번호는 국가에 따라 변경될 수 있습니다. |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 시그마-알드리치 | D2650 | / |
| 에틸렌 글리콜(EG) | 시그마-알드리치 | E9129 | / |
| 소 태아 혈청(FBS) | 시그마-알드리치 | F9665 | / |
| 유리 파스퇴르 피펫 | / | / | 권장 길이 230mm(100+130) |
| 고벨렛 | / | / | 저장 탱크의 캐니스터에 따름 |
| 난방 단계 | / | / | 모든 난방 단계는 38°C를 지킬 수 있는 한 좋습니다; C |
| 액체 질소 | / | / | /중간 |
| 199 | 시그마-알드리치 | M4530 | / |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 시그마-알드리치 | D8662 | / |
| 페니실린 G 나트륨 | 시그마-알드리치 | P3032 | / |
| 폴리비닐 알코올(PVA) | 시그마-알드리치 | P8136 | / |
| 재현 플레이트 | Kitazato (유통업체: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | 유통업체 및 카탈로그 번호는 국가에 따라 변경될 수 있습니다 |
| . 실체현미경 | / | / | 작업자가 난모세포를 선택할 수 있는 한, 다른 실체현미경은 괜찮습니다 |
| . 저장 탱크 | / | / | 정기적으로 채워진 탱크는 모두 정상입니다 |
| 스트렙토마이신 황산염 | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| 스티로폼/질소 내성 상자 | / | / | 작업자가 편안하다면 액체 질소를 포함할 수 있는 모든 상자는 괜찮습니다. 키타 자토 상자는 "쿨링 랙"이라고 불리며 |
| ,Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | 9분까지 시간을 설정할 수 있는 모든 타이머는 OK입니다 |
참고문헌
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
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재인쇄 및 허가
