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방법 논문

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

6.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61523

⸱

2020년 6월 24일

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

이 논문에서

요약

이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.

초록

야생 동물의 보존 프로그램에서 gamete 뱅킹은 귀중한 개인과 희귀 종의 유전 자원을 보호하고 생물 다양성 보존을 촉진하는 데 매우 중요합니다. 고양이에서, 대부분의 종은 멸종 위협, 국내 품종은 세균 은행 프로토콜의 효율성을 높이기 위해 모델로 사용된다. 난염 극저온 보존 기술 중, 유리화는 인간과 수의학 지원 생식에서 점점 더 인기가 있습니다. 인간 난모세포와 배아를 위해 처음 개발된 극저온 상체화는 고양이 난모세포에 적합하다는 것을 입증했습니다. 이 방법은 여러 샘플을 처리해야 할 때 유용할 수 있는 현장 조건의 타당성 및 절차 속도와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 그러나 효율성은 작업자의 기술에 크게 의존하며, 실험실 간 표준화와 인력 교육이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소 수집에서 온난화에 이르기까지 단계별 필드 친화적 인 프로토콜에 의해 단계적으로 상업적 지원에 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화를 설명합니다. 프로토콜에 따라 온난화시 난낭 무결성 및 생존 가능성 보존(90%까지 높음) 온난화 후 성숙과 배아 발달 결과에 개선을 위한 여지가 여전히 남아 있지만, 예상될 수 있습니다.

서론

냉동 보존은 보조 재생 기술 (ARTs)의 핵심 단계가되었습니다. 인간에서는, 그것은 의학 또는 개인적인 이유로 부모의 불임 또는 연기의 보존을 허용합니다. 동물에서는 계획된 짝짓기, 특히 농장 동물과 애완 동물에서 거리와 시간을 극복하거나 특히 야생 멸종 위기에 처한 종의 보존 프로그램에서 귀중한 과목의 유전 물질을 보존할 필요가 있습니다. Gamete 냉동 보존은 사육할 개인이 아직 선택되지 않았거나 배아 동결과 관련된 윤리적 문제를 피하기 위해 선택되지 않았을 때, 특히 인간 의학1에서최선의 선택입니다. 정자는 해동 후 비교적 보존하고 만족스러운 결과를 제공하기 쉽지만, 구조적인 특징으로 인해 난모세포는 보관하기가 더 복잡할 수 있습니다. 실제로, 낮은 표면/부피 비뿐만 아니라 우플라즈마를 둘러싼 조나 펠루치다의 존재는 셀2를가로지르는 극저온 보호제와 물의 이동을 제한한다. 또한, 골뚜껑을 포함한 국산 동물에서는 지질이 풍부한 세포질이 특징이며, 이는 냉동 보존3에더 민감하게 반응할 것으로 생각된다.

대부분의 고양이는 위협을 받고 있으며, 국내 고양이는 일상적인 ovariectomy에서 생식샘의 가용성 덕분에 세균 보존을위한 프로토콜을 개발하는 모델로 사용됩니다. 야생 동물에서는, 생식강은 선택적 수술 후 또는 (더 자주) 사후 사후후에 얻을 수 있고, 미숙한 (발아 소포) 게임테스는 회수될 수 있습니다. 성숙한 (담수 II) 난모세포는 치료4에대한 윤리적 문제와 종 및 개별별 반응으로 인해 인간 ART에서와 같이 일반적이지 않다.

따라서, 냉동 보존 전략의 개발은 일반적으로 희귀 한 개인의 예기치 않거나 갑작스런 죽음 후 검색 할 수있는 미숙한 게임에 초점을 맞추고있다. 생물학적 관점에서, 미숙하거나 성숙한 게임족의 냉동 보존에 약간의 차이가 있습니다. 첫째, DNA는 미성숙 한 난모세포에서 더 보호되며, 발아 소포에는 핵 막으로 둘러싸인 염색체가 포함되어 있으며, 메타 위 II 난우세포의 메이오틱 스핀들 (meiotic spindle)은 극저온 부상5에더 취약 할 수 있습니다. 둘째, 냉으로 유발된 사이토스켈레톤 손상은 척추 회전, 극지 체압, 핵 이동 및 사이토카네시스에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 난소 세포 발달 단계에 따라 다른 영향을 미칠 수 있으며, 이는 메이오시스 진행 또는 후 수정 사건에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 아마도 가장 중요한 것은, 성숙한 난모세포가 수정될 준비가 되어 있는 반면, 미숙한 게임들은 핵과 세포질성숙6을통과하기 위해 주변 적혈구의 지원에 의존하며, 이것이 전체 적혈구-오낭복합체(COC)가 극저온보존되는 이유입니다. 그러나, 적혈구의 손실 및/또는 게임및 주변 체세포 사이 기능적인 연결의 손실은 아마 미숙한 COCs의 극저온 보존의 가장 해로운 효력일 것입니다.

극저온 보존 기술 중, 진동은 필드 조건에서 더 쉽게 적용 할 수있는 하나입니다. 느린(또는 제어 속도) 동결에 비해, 유리화는 빠르며 프로그래밍 가능한 냉동고와 같은 특정 장비가 필요하지 않습니다. 유리화의 세 가지 기본 원칙(즉, 높은 점도, 높은 극저온 보호 농도, 소량 및 초고속 온도 감소)을 충족시키기 위해, 여러 미디어와 지지는 특히 미숙하고 성숙한 난모세포 모두에 대해 고양이에서 개발및 사용되었습니다. 간단한 빨대7로시작하여 장치가 개발되어 "최소 볼륨"목표에 도달했습니다. Cryoloop8,오픈 풀기 빨대 (OPS)9,플라스틱 배수구 (수정 된 빨대)10 및 냉동 튜브(11)가 사용되었으며, 보다 효율적인 장치 (즉, Cryotop)가11을고용하여 생존 및 메이오시스 재개를 개선하였다. 극저온(보충도1)은시험신화를 위한 선택개방 시스템이 된 시판지원이다. 인간 난모세포와 배아의 유리화를 위해 개발된 이 스트립은 단단한 플라스틱 홀더에 부착된 작은 필름 스트립으로 구성되어 있으며, 저장12에서플라스틱 튜브 캡에 의해 보호된다. 사용효과와 매우 빠른 냉각 및 온난화 율로 이어지는 유리화 부피(0.1 μL 만큼 약간)의 극단적인 감소덕분에, 이 병신 지원은 다양한 미디어,13,,14,15,16,17로사용되고 있는 국내 고양이를 포함한 여러 종에서 점점 더 많이 적용되고있다.,

이 원고의 목적은 수집 -유리화 온난화 프로토콜을 설명하는 것입니다, 원래 인간의 난모세포에 대해 개발 된 것에서 사소한 수정, 이는 실험실 만든 미디어 및 최소 볼륨 유리화에 대한 상업 지원을 고용하고 미숙한 고양이 COC의 냉동 보존을위한 필드 조건에서 쉽게 적용 할 수 있습니다.

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프로토콜

이에 따라 묘사된 절차는 고양이 난소가 수의장에서 주인이 요청한 일상적인 혈관 절제술 또는 혈관 절제술의 부산물로서 수집되었기 때문에 윤리적 승인을 받지 못했습니다.

1. 오사이클 컬렉션

  1. 실험을 시작하기 전에 난소 및 난소 수집을 위한 솔루션을 준비합니다. 항생제와 항마이코틱스(페니실린 G 나트륨 100 IU/mL, 연쇄상 구균 황산염 0.1 mg/mL, 암포테린 비의 0.25 μg/mL)의 혼합물로 인산염 완충식식염(PBS)으로 난소 수집 용액을 준비한다. 페니실린 G 나트륨 100 IU/mL, 연쇄상 구균 황산염 0.1 mg/mL, 0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA)을 갖춘 PBS를 갖춘 난낭수 수집 솔루션(예: PBS/PVA)을 준비합니다.
  2. 난소 및 난소 수집용 솔루션을 4°C에서 사용할 때까지 보관하십시오.
  3. 퀸즈의 지불 당일, 샘플을 처리하기 몇 시간 전에 난소 및 난소 수집 솔루션의 일부를 취하고 실온 (RT; 25 ± 2 °C)에서 따뜻하게하십시오.
  4. 샘플이 실험실에 도착하면 난소를 주변 결합 조직과 oviduct에서 분리하고 페트리 접시에 신선한 난소 수집 매체로 세척합니다.
  5. 각 여왕에 대해 35mm 페트리 접시를 RT PBS/PVA 3mL로 채우고, 한 접시를 더 모아 서두르는 접시를 채웁니다.
  6. 페트리 접시에 난소 한 켤레를 놓고 외과 메스로 피질을 다진다. 모든 여포가 스테레오 현미경 (배율 8x)의 도움으로 파손되었는지 확인하십시오.
  7. 파이펫으로 COC를 수집하고 할당 된 페트리 접시에 신선한 PBS / PVA로 이동합니다. 균일하고 어두운 세포질이 있는 좋은 자질 COC를 선택하고 여러 개의 소형 층으로 둘러싸여 있습니다(I18등급).

2. 진동

  1. 평형 및 유리화 매체를 준비합니다.
    1. 199년 중간199년에 7.5%(v/v) 에틸렌 글리콜(EG) 및 7.5%(v/v) 디메틸설프산화물(DMSO)을 20% 태아소 혈청(FBS)으로 준비한다.
    2. 15%(v/v) EG, 15%(v/v) DMSO, 중간 199M 0.5M 자당으로 진동용액(VS)을 준비하여 20%의 FBS(19일부터수정)를 준비한다.
    3. 사용하기 전에 RT에서 ES 및 VS를 따뜻하게 하십시오.
      참고: 극저온보호제(예를 들어, EG, DMSO)는 세포독성으로 알려져 있다. 그들의 독성에 대처하기 위한 전략은 세포가그(것)들에드러내는 온도를 감소시키는 것입니다 20, 그리고 난모세포는 일반적으로 RT에 저온 보호제에 드러난다. 따라서, 오낭 수집에서 진동화에 이르는 전체 절차는 온도 변동을 피하기 위해 이 프로토콜의 RT에서 수행됩니다.
  2. 유리화 접시를 준비하십시오 (즉, "Repro 플레이트"라고 하는 두 줄로 나뉘어진 6 개의 원적 우물로 구성된 특별한 요리). 각 진동 지원에 대해 하나의 행(3개의 우물)을 준비합니다.
    1. 첫 번째 우물 의 바닥에 20 μL의 ES를 추가합니다.
    2. 두 번째(즉, 1VS) 및 세 번째(즉, 2VS) 우물의 하단에 VS 300 μL을 추가합니다.
  3. ES에서 COC를 평형화합니다.
    1. 작은 보어 파이펫(예: 분젠 부리에 당겨서 더 얇아지도록 하는 파스퇴르 파이펫을 사용하면 직경이 200 μm 이상이어야 함), 첫 번째 우물 바닥에 하나(또는 그 이상) COC를 전송합니다.
      참고: 난모세포를 둘러싼 적혈구의 수에 따라 파이펫의 크기를 선택하므로 COC 치수에 각 단계에서 COC로 전송되는 미디어의 양을 가능한 한 많이 줄이는 것을 목표로 합니다. 현재 프로토콜을 사용하면 숙련된 연산자는 각 진동 지원당 최대 8개의 고양이 COC를 성공적으로 진동할 수 있습니다.
    2. 드롭 테두리에 20 μL의 ES를 천천히 추가합니다. 3분 간 기다립니다.
    3. 드롭 의 테두리에 다른 20 μL의 ES를 천천히 추가합니다. 3분 간 기다립니다.
    4. 드롭 테두리에 240 μL의 ES를 천천히 추가합니다. 9분 간 기다립니다.
    5. 기다리는 동안 액체 질소(LN2)로상자를 준비하고 실험/고양이 식별 코드로 유리화 지지체에 라벨을 부착하고 열어 둡니다. 두 가지를 스테레오 현미경 근처에 두어 작업 하는 동안 쉽게 연결할 수 있습니다.
      주의! LN2를취급할 때 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    6. 또는 여러 COC를 바이트화해야 하는 경우 다른 COS 그룹(새로운 진동 지원에 로드됨)에 대한 첫 번째 평형 단계(단계 2.3.1 - 2.3.2 참조)를 시작합니다.
  4. 90초 이내에 VS의 COC를 진동시합니다.
    1. 동일한 작은 보어 파이펫을 사용하여 1VS로 채우고 첫 번째 우물 (ES)의 바닥에서 COC를 가져 와서 두 번째 우물 (1VS)의 표면으로 이동하십시오.
    2. 파이펫을 1VS로 씻으시다.
    3. COC를 가져 와서 우물의 다른 영역 (하단)에서 이동하십시오. 주변 의 매체를 파이펫과 섞는다.
    4. 파이펫을 웰의 다른 영역에서 1VS로 채우고, COC를 가져 와서 이동하고 주변의 매체를 파이펫과 혼합합니다.
    5. 반복 단계 2.4.4.
    6. 파이펫을 2VS로 씻으시다.
    7. COC를 가지고 세 번째 우물 (2VS)의 바닥에 이동; 주변 의 매체를 파이펫과 섞는다.
    8. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 2VS로 채우고, COC를 가져 와서 이동하고 주변의 매체를 파이펫과 혼합합니다.
    9. 2.4.8 단계를 반복합니다.
    10. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 2VS로 채우고, COC를 가지고, 팁에 가능한 한 가깝게 진동 지지대에 로드합니다. 초과 배지를 흡인하여 VS의 부피를 최대한 감소시려면.
    11. 즉시 LN2에서유리화 지원을 급락, 그것을 이동. 일부 클램프의 도움으로 닫고 항상 LN2에침지되어 있는지 확인하십시오.
      참고: 저온 보호제 세포 독성으로 인해 적절한 타이밍을 유지하는 것이 중요합니다. 유리화 매체에서 의 고농도 때문에, 세포 노출은 또한기술(21)의완벽한 실행에 의해 제어될 필요가 있다. 샘플이 풍부한 경우 샘플을 더 빨리 처리하고 오사이클 컬렉션에서 유리화까지의 시간을 최소화하도록 나누는 것이 좋습니다.
  5. 로드된 유리화 지지대를 잔에 보관하고 온난화가 될 때까지 저장 LN2 탱크에 보관하십시오.
    참고: LN2를 사용할 수 있는 경우 프로토콜의 이전 모든 단계를 필드 조건에서 적용할 수도 있습니다. 건조한 화주들은 샘플을 실험실로 안전하게 운반한 다음 다음 단계로 진행해야 합니다.

3화 온난화

  1. 온난화 미디어를 준비합니다.
    1. 1999년 1M 자당으로 20%의 FBS를 장착하여 해동 솔루션(TS)을 준비합니다.
    2. 중간 199에서 0.5 M 자당으로 희석 용액 (DS)을 준비하고 20 % FBS를 준비합니다.
    3. 20% FBS로 중간 199로 세척 용액(WS)을 준비합니다.
    4. 사용하기 전에 RT에서 TS를 38 °C 및 DS 및 WS로 따뜻하게하십시오.
  2. 필요한 경우, 따뜻한 COC의 후속 사용을 위해 배양 매체를 준비한다(예: 시험관 내 성숙, IVM).
  3. 가열 단계를 스테레오 현미경에 가깝게 놓고 켜십시오 (38 °C). 페트리 접시 뚜껑을 따뜻하게 해주세요.
  4. 모든 것이 준비되면 저장 탱크에서 LN2가있는상자에 따뜻하게해야하는 유리화 지지대를 전송하고 스테레오 현미경 근처에 상자를 놓습니다.
  5. "Repro 플레이트"를 준비합니다. 따뜻하게 해야 하는 각 진동 지원에 대한 행을 준비합니다.
    1. 첫 번째 우물 바닥에 300 μL의 DS를 추가합니다.
    2. 두 번째(즉, 1WS) 및 세 번째(즉, 2WS) 우물의 하단에 300 μL의 WS를 추가합니다.
  6. 페트리 접시 뚜껑에 TS(100 μL)를 한 방울 만드십시오.
  7. 클램프를 사용하면 LN2에서하나의 진동 지원을 엽니다.
  8. TS 드롭을 스테레오현미경 아래에 놓고 빠른 움직임으로 LN2의 진동 지원을 받아 스트립을 드롭에 몰입하여 모든 COC가 분리될 때까지 이동합니다. 비어 있는 즉시 드롭에서 지원을 제거하지만 CC를 총 1분 동안 TS에 둡니다(침수에서 다음 단계까지).
  9. 유리화에 사용되는 것과 유사한 파이펫을 가져 와서 DS로 채웁니다. 드롭(TS)에서 COC를 가져 와서 첫 번째 우물 (DS)의 바닥으로 이동합니다. 3분 간 기다립니다.
  10. 파이펫을 1WS로 씻으시다. COC를 가져 와서 두 번째 우물 (1WS)의 하단에 이동합니다. 5 분 동안 기다립니다.
  11. 파이펫을 2WS로 씻으시다. COC를 가져 와서 세 번째 우물 (2WS)의 표면에 이동합니다. 그들이 우물의 바닥을 만질 때까지 기다립니다.
  12. 웰의 다른 영역을 사용하여 3.11 단계를 반복합니다.
  13. 배양 매체로 파이펫을 세척하고 다음 사용을 위해 배양 접시에 난모를 이동(예: IVM).

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결과

현재 프로토콜(도 1 및 보충도1)에 따라 고양이 의진동및 온난화에 따라 대부분의 게임테가 살아남습니다. 생체화 후, 다른 기술 중에서도 생체내성(22)으로 광학 현미경에서 또는 중요한 얼룩을 사용하여 생존성을 평가할 수 있다. 후자 중 하나는 형광 희석제 /propidium 요오드 (FDA/PI), 실행 가능한의 식별을 허용 (밝은 녹색 형광) 및 죽은 세포 (적색 형광). 도 2는 온난화 직후 FDA/PI로 염색된 유리화된 온난 고양이 COC의 대표적인 그림을 보여줍니다. 시험신도 후 생존의 비율을 보여주는 실험에서 얻은 데이터는 체외성숙(17) 또는 체외 배아생산(16)을위한 난모세포의 온난화 후 데이터를 묘사한 표 1에보고된다. ...

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토론

오키테 냉동 보존은 특히 펠리대 가족과 같이 많은 종들이 멸종 위기에 처한 택시에서 중요한 세균 보존 기술입니다. 이 원고에서는 미숙한 고양이 난모세포의 유리화를 위한 간단하고 현장 친화적인 프로토콜이 제시되었습니다. 실험실에서 만든 미디어, 최소 볼륨 바이트화 지원 및 훈련 된 인력은이 방법의 성공을위한 핵심 요소이며, 이는 실행 가능한 난모세포를 일관되고 반복적으로 얻을 수 있습니다, 여기에보고 된 대표적인 결과에 의해 표시된 바와 같이.

미디어 준비부터 최상의 결과를 보장하기 위해 프로토콜을 정확하게 따라야 하지만 운영자의 기술이 주요 문제입니다. 미디어는 유리화 절차의 당일을 준비해야 하며, 가능하지 않은 경우 전날 준비하여 4°C로 보관해야 한다. 어쨌든, 샘플 처리 전에, 충분한 시간을 남겨두어야 하여 솔루션이 RT까지 예열될 수 있도록 충분한 시간을 남겨두어야 합니다. 오사이클 컬렉션 및 COC 선택은 모든 ARTs 실험실에서 일상적으로 수행하는 빠르고 간단한 절차입...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 부분적으로 EVSSAR에 의해 지원되었다 (작은 동물 재생을위한 유럽 수의학 협회) 그랜트 2016 및 Università degli Studi 디 밀라노, 피아노 디 소스테그노 알라 Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A)에 의해 지원되었다. 또한 마리아조르지아 모셀리 박사가 이 실험에 기여한 것에 대해 감사드리며, 이미지 수집에 기여하고 자합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amphotericin BSigma-AldrichA2942/
자동 피펫 및 팁//피펫 20, 100, 240 및 300 & 마이크로에 필요; L
수술용 메스//크기 10은 일반적으로 괜찮습니다
분젠 부리///
클램프/난소 격리를 위한 작은 것(모기 클램프), 액체 질소에서 작동하는 더 큰 것(클레머 클램프)
CryotopKitazato(유통업체: MBT - Medical Biological Technologies)01.CR유통업체 및 카탈로그 번호는 국가에 따라 변경될 수 있습니다.
디메틸설폭사이드(DMSO)시그마-알드리치D2650/
에틸렌 글리콜(EG)시그마-알드리치E9129/
소 태아 혈청(FBS)시그마-알드리치F9665/
유리 파스퇴르 피펫//권장 길이 230mm(100+130)
고벨렛//저장 탱크의 캐니스터에 따름
난방 단계//모든 난방 단계는 38°C를 지킬 수 있는 한 좋습니다; C
액체 질소///중간
199시그마-알드리치M4530/
인산염 완충 식염수(PBS)시그마-알드리치D8662/
페니실린 G 나트륨시그마-알드리치P3032/
폴리비닐 알코올(PVA)시그마-알드리치P8136/
재현 플레이트Kitazato (유통업체: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2유통업체 및 카탈로그 번호는 국가에 따라 변경될 수 있습니다
. 실체현미경//작업자가 난모세포를 선택할 수 있는 한, 다른 실체현미경은 괜찮습니다
. 저장 탱크//정기적으로 채워진 탱크는 모두 정상입니다
스트렙토마이신 황산염Sigma-AldrichS9137/
스티로폼/질소 내성 상자//작업자가 편안하다면 액체 질소를 포함할 수 있는 모든 상자는 괜찮습니다. 키타 자토 상자는 "쿨링 랙"이라고 불리며
,SucroseSigma-AldrichS1888/
Timers//9분까지 시간을 설정할 수 있는 모든 타이머는 OK입니다
. /. .

참고문헌

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