방법 논문

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

DOI:

10.3791/61527

⸱

2020년 6월 30일

 , 
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

초록

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세포 이동은 생리학적 및 병리학 적 사건의 핵심 구성 요소입니다. 면역 반응의 발달 및 장착과 같은 필수 기능에 는 정상적인 세포 이동이 필요합니다. 세포 이동 프로세스에 결함이나 변경이 발생하면 해로운 결과(즉, 암 전이, 상처 치유 및 흉터 형성)가 발생할 수 있습니다. 세포 마이그레이션의 중요성때문에, 저렴하고 적응가능하며 반복가능한 세포 마이그레이션 분석서에 접근할 필요가 있습니다. 일반적인 스크래치 마이그레이션 분석을 활용하여 일반 실험실 장비를 사용하는 세포 마이그레이션을 분석하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 설명된 방법은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고 관심있는 특정 영역을 다시 캡처 할 수있는 시각적 마커를 사용합니다. 또한, 이동 매트릭스 기판 변경에서 약리학적 수정제의 첨가에 이르기까지 실험 설계의 유연성을 제공한다. 또한 이 프로토콜은 셀 마이그레이션을 검사할 때 여러 가지 방법으로 간주되지 않는 셀 마이그레이션 영역을 설명하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 새로운 접근은 더 큰 청중에게 스크래치 이주 분석법을 제공하고 연구원이 세포 이동의 생리적 및 병리학적 영향을 검토 할 수있는 더 큰 기회를 제공 할 것입니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 이동은 많은 생리학적 뿐만 아니라 병리학적 사건에 매우 중요합니다. 개발 중, 면역 반응을 장착하고, 적절한 상처 치유1,2,3이필요합니다. 이러한 세포 마이그레이션 이벤트의 대부분은 물리적 또는 화학적 신호에 의해 트리거될 수 있습니다. 예를 들어, 면역 반응 중에 백혈구는 화학 요법2에대응하여 부상 부위로 이동합니다. 또한, 백혈구는 또한 상처 치유 과정에 관여하는 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형뿐만 아니라 추가 면역 세포의 이동을 유도하기 위해 사이토카인을 방출하여 다세포 반응4를시작한다. 이동하는 세포의 능력은 적절한 생리적 기능에 필수적입니다. 그러나, 세포 이동이 확인되지 않을 때, 그것은 불리한 반응을 가질 수 있고 만성 염증, 혈관 질환, 암 전이 및손상된 상처 치유2,3,4,5,6,7과같은 병리학적 사건에 기여할 수 있다. 손상된 상처 치유는 세포 이동의 결함으로 인한 당뇨병 환자의 일반적인 고난이며, 이러한 결함이 해결되지 않으면 추가 합병증(예: 절단8,9)으로이어질 수 있습니다. 이 연구 결과는, 그 외, 세포 이주가 일어나는 과정을 추가로 이해하는 필요성을 표시했습니다, 일반적인 생리학 또는 병리학적인 조건의 밑에, 그리고 연구의 이 필드를 발전시키기위한 것이 중요합니다. 이를 달성하기 위해서는 이러한 조사를 수행하는 데 필요한 장비를 소지하지 않을 수 있는 연구자들에게 접근 가능하고 저렴한 마이그레이션 에세이가 있어야 합니다.

현재 셀 마이그레이션과 관련된 다양한 주제를 검사할 수 있는 다양한 마이그레이션 에세이가 있습니다. 각각 셀 마이그레이션에 영향을 미치는 특정 영역을 대상으로 2D 및 3D 마이그레이션 모델이 모두 개발되었습니다. 3D 마이그레이션 모델은 전형적으로 세포 침입 연구와 연관되고 세포 이동10,11,12에세포 외 매트릭스의 영향을 평가하는 반면, 2D 마이그레이션 소는 적용 범위가 크고 주로 세포 마이그레이션13,14, 15,16동안 화학 작용, 상처 치유 및 기능적 변화를 연구하는 데 사용된다. 이러한 소의 몇몇은 특정 연구원에게 이 사실의 가용성을 감소시킬 수 있는 보이든 챔버 또는 배제 반지와 같은 추가 장비가 필요합니다. 보다 비용 효율적인 분석 방법 중 하나는 일반적으로 상처 치유 및 세포 마이그레이션14,17의일반적인 변화를 평가하는 데 사용되는 스크래치 분석이다. 대부분의 실험실은 스크래치 분석기를 수행하도록 장착되어 있지만 셀 마이그레이션을 추적하는 데 사용되는 장비는 사용할 수 없거나 구매비용이 너무 많이 드는 경향이 있습니다. 이것은 반전된 현미경 및 살아있는 화상 진찰 시스템을 요구하는 시간 경과 현미경 검사를 포함합니다. 이러한 고가의 장비는 모든 실험실에서 일반적으로 접근할 수 없습니다. 따라서 이 관찰은 보다 쉽게 사용할 수 있는 장비로 세포 마이그레이션을 평가할 수 있는 새로운 프로토콜의 필요성을 강조합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 세포 마이그레이션을 평가하는 새롭고 저렴한 방법을 제공합니다. 이 방법은 스크래치 분석과 관련된 동일한 절차를 따르지만 기본 과학 실험실 환경에서 더 일반적으로 사용할 수있는 장비를 활용하여 세포 이동을 검사하는 분석에서 다릅니다. 일반적인 장비를 사용하는 이 프로토콜은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고도 세포 이동을 보다 정확하게 판단할 수 있습니다. 마이그레이션을 결정하는 것 외에도 이 메서드는 셀 마이그레이션에 큰 영향을 미치는 것으로 지적된 스크래치 영역의 가변 요인을 고려합니다. 전반적으로, 세포 마이그레이션 분석을 위한 이 새로운 프로토콜은 더 많은 실험실이 세포 마이그레이션 분야에 탐구하고 기여할 수 있는 기회를 제공합니다.

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프로토콜

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1. 일반 세포 배양

  1. 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)에서 1g/L 포도당을 함유한 배양 심장 섬유아세포, 나트륨 피루바테, L-글루타민, 14.2 mM NaHCO3,14.9 mM HEPES, 15% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 2 % L-글루타민, 0.02 % 항균 시약 (재료의 표참조) 및 CO2에서 유지 보수37.
  2. 90-95%까지 배양 심장 섬유아세포는 통로 0 (P0)에서 도달합니다. 이 시점에서 섬유아세포는 마이그레이션 분석에 사용되는 48웰 플레이트로 나눌 준비가 되어 있습니다.

2. 이주 판 준비

  1. 48웰 세포 배양판을 선으로 그리고, 노란색 또는 밝은 색의 영구 마커를 사용하여, 우물의 중앙 아래로 준비한다. 그런 다음, 관심의 세 가지 별도 영역으로 우물을 분할 세 해시 마크를 그립니다. 이 단면도는 화상 진찰을 위해 이용될 것입니다.
    참고: 밝은 색상 영구 마커를 사용하면 마이그레이션 셀의 쉬운 이미징이 허용됩니다. 검은 색 또는 파란색과 같은 어두운 마커는 마이그레이션 셀의 시각화를 방지합니다.
  2. 기판(예를 들어, 콜라겐)에서 의 이주를 평가하는 경우, 특정 기판에 사용되는 지침과 농도에 따라 이 때 우물을 코팅한다.
  3. 플레이트 ~15,000-20,000 심장 섬유아세포, P1, 각 우물 및 배양 세포로, 정상적인 배양 조건 (이전 섹션에 나열된 조건)에 따라 90-95 %의 합류에 도달 할 때까지. 24~48시간 사이에 는 인플루엔자에 도달해야 합니다.
    참고: 마이그레이션 플레이트를 설정할 때 양수 제어(예: 3T3 셀18)및 음수 제어(긁지 않은 셀) 및 빈 우물을 포함해야 합니다.

3. 스크래치 마이그레이션 분석 및 고정

  1. 세포가 90-95%의 합류에 도달하면 멸균 P200 파이펫 팁을 사용하여 그려진 선을 따라 미디어와 스크래치를 제거합니다.
    참고 : P200 파이펫 팁은스크래치분석10,14,19와함께 사용되는 일반적인 파이펫 팁 크기입니다. 또한 P200 팁으로 한 번만 패스하면 두 번 이상의 시도가 여러 번 스크래치 라인을 초래할 수 있습니다.
  2. 낮은 혈청 미디어 (1.5 % FBS)로 우물을 헹구어 부착되지 않은 심장 섬유 아세포를 제거하십시오.
  3. 각 웰에 500 μL의 낮은 혈청 미디어를 추가합니다. 약리학 에이전트를 사용하는 경우, 이 시간에 그들을 추가합니다.
    참고: 낮은 혈청 매체는 세포 이동이 발생할 수 있도록 허용/촉진하고 마이그레이션 분석20의결과를 왜곡할 수 있는 섬유아세포가 확산되는 것을 방지하기 때문에 사용됩니다. 이 프로토콜의 경우 1.5%의 FBS가 사용되었습니다.
  4. 24시간 동안 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 섬유아세포를 배양하기 전에 0h 이미지를 캡처합니다.
    1. 20배 의 목표와 반전 된 현미경을 사용하여 0 h 이미지를 캡처합니다. 잘 당 두 개의 0 h 이미지를 가져 가라. 이렇게 하면 마이그레이션 줄에 대한 보다 완벽한 커버리지가 허용됩니다.
    2. 표시(선 및 대시)를 사용하여 우물을 배치하여 스크래치 라인의 위쪽 절반을 캡처합니다. 중간 대시를 이미징하지 말고 동일한 마이그레이션 영역이 두 번 이미지되지 않도록 하여 결과가 왜곡될 수 있습니다.
    3. 이미징소프트웨어(재료 표)를사용하여 #1 0h 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 카메라를 볼 때 플레이트를 이동하여 우물/스크래치 선의 하반부반을 배치합니다. 다시 말하지만 중간 대시를 캡처하지 마십시오. 일단 제자리에, 캡처 0 h 이미지 #2(그림 1).
      참고: 0h 이미지 모두에서 중간 대시를 피하면 마이그레이션 영역을 두 번 캡처할 수 없게 되어 반복 결과를 생성하고 데이터를 왜곡할 수 있습니다.
  5. 24시간 동안 배양한 후, 우물에서 미디어를 제거하고, 1x 비멸PBS로 우물을 씻는다(이제부터 는 모든 1x PBS가 사용되지 않습니다).
  6. 연기 후드에, 우물에 4 % 파라 포름 알데히드의 500 μL을 추가하고 실온 (RT)에서 10 분 동안 배양한다.
  7. 파라포름알데히드를 제거하고 RT에서 각각 5분 동안 1x PBS로 3배 세척합니다.
  8. 세포가 세척되면 24h 이미지를 캡처하거나 각 우물에 1x PBS를 추가하고 나중에 까지 4 °C에 배치하십시오. 세포는 이미지에 준비 될 때까지 1-2 주 동안 4 ° C에서 머물 수 있습니다.
    1. 각 웰에 300 μL의 퍼메아빌라이징 용액(1x PBS 및 0.01% 트리톤 X-100)을 추가하여 세포를 투과화한다. RT에서 30 분 동안 부드럽고 지속적인 흔들림으로 세포 / 접시를 배양하십시오.
    2. 퍼메아빌리징 용액을 제거하고 1% 쿠마시 브릴리언트 블루 스테인(쿠마시 브릴리언트 블루 3%, 아세트산 10%, 메탄올 45%, dH2O 45% 분)을 10분 동안 부드럽고 지속적인 흔들림으로 추가합니다.
      참고: 플레이트가 세포외 매트릭스 기판으로 코팅된 경우 마이그레이션 분석을 수행하기 전에 쿠마시 염색으로 코팅된 플레이트를 테스트해야 합니다. 도 2는 매트릭스 기판이 이 분석기와 함께 사용될 수 있으며 세포의 시각화에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.
    3. RT에서 1x PBS로 3배 의 웰을 씻어 내고 5분 동안 계속 흔들리면 됩니다.
    4. 세차 후, 1x PBS의 300 μL을 추가하고 24시간 이미지를 캡처합니다.
    5. 0h 이미지를 캡처하는 데 사용된 동일한 위치에 웰을 정렬하여 24h 이미지를 캡처합니다. 이를 수행하기 위해 이전에 캡처한 0h 이미지를 열고 영구 마커로 만든 마킹을 사용하여 동일한 위치에 잘 정렬합니다. 가운데 및 추가 대시 마크 아래로 선은 24h 이미지와 0h이미지(그림 1)사이의긴밀한 정렬을 허용해야 합니다.

4. 0 h 및 24 h 이미지 의 준비

  1. 동일한 웰과 이미징 소프트웨어(재료 표)에서 동일한 우물과 위치의 촬영 된 0 h 및 24 h 이미지를 엽니다.
  2. 0h 이미지에 새 레이어를 만듭니다. 그런 다음 새 레이어를 클릭하고 텍스트를 두 번 클릭하여 레이어의 이름을 "줄 레이어"로 변경합니다.
    참고: 이 레이어를 이 시점부터 선 레이어라고 합니다.
  3. 브러시 도구(브러시 아이콘)를 클릭하고 크기를 10px로 설정하고 색상을 빨간색으로 설정합니다.
  4. 선 레이어를 선택하면 스크래치 영역을 설명하는 두 개의 별도의 선을 그립니다. 이 선이 마이그레이션 영역을 표시하는 이러한 선으로 인해 셀을 만지지 않아야 합니다.
  5. 이동 도구(화살표 아이콘)를 클릭한 다음 Ctrl 버튼을 누릅니다.
  6. 0h 이미지의 가운데를 클릭하고 이러한 레이어를 24h 이미지의 중간으로 드래그합니다.
  7. 이제 24h 이미지를 사용하여 0 h 배경 레이어를 클릭하고 불투명도를 50%로 변경합니다.
  8. Ctrl 버튼을 들고 0h 배경과 선 레이어를 모두 클릭한 다음 레이어를 자유롭게 변환합니다(편집>무료변환). 무료 변환을 사용하여 0h 배경 및 선 이미지를 24h 배경 이미지에 정렬합니다. 이 단계는 0h 및 24h 이미지를 오버레이하는 결과를 초래하며, 이는 24h 이미지에서 마이그레이션 영역을 표시하는 선을 위치시키는 데 필요합니다.
  9. 0h 배경 및 선 레이어를 24h 배경 이미지에 성공적으로 오버레이한 후 0h 배경 레이어를 삭제합니다. 0h 배경 레이어를 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 레이어 삭제를 클릭하여 삭제합니다.
  10. 0h 배경 이미지를 삭제하면 선과 24h 배경 레이어(이제 마이그레이션 이미지라고 함)만 남게 됩니다. 선 레이어는 24h 이미지에서 마이그레이션/스크래치 영역을 나타내며 마이그레이션 셀 수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
  11. 포토샵 파일과 TIFF/JPEG로 새 마이그레이션 이미지로 저장합니다. 참고: 이 프로세스를 묘사하는 대표적인 그림은 그림 3에표시됩니다.

5. 마이그레이션 셀 수 계산

  1. 마이그레이션 이미지를 엽니다. 이것은 TIFF / JPEG 파일(재료의 표)를수락하는 프로그램에서 수행 할 수 있습니다.
  2. 두 개의 빨간색 선을 터치뿐만 아니라 사이에있는 셀수를 계산합니다.
  3. 이미지당 마이그레이션 셀 수를 기록합니다. 웰당 두 개의 마이그레이션 이미지가 있을 것이며, 이러한 값은 마이그레이션 영역에 대해 값을 수정한 후(다음 섹션에 자세히 설명)까지 결합해서는 안 됩니다.

6. 마이그레이션 영역 결정

  1. 제5항(자료표)에서 이미징 소프트웨어 프로그램에서 마이그레이션 라인을 포함하는 24h 이미지를엽니다.
  2. 이 이미지를 "마이그레이션 영역 이미지"로 저장합니다.
  3. 저장한 후 백그라운드 레이어를 클릭하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 레이어 삭제를 클릭합니다. 이렇게 하면 이미지에 스크래치 라인만 남게됩니다(그림 3).
  4. 브러시 도구(브러시 아이콘)를 사용하여 스크래치 선 사이의 영역을 채웁니다. 브러시의 색상을 마이그레이션의 선을 그리는 데 사용되는 색상과 일치합니다.
  5. 이미지를 회색으로 변경하여 흑백이미지(Image>Mode>Grayscale)를생성한 다음 이미지를저장합니다(그림 4).
  6. 분석소프트웨어(재료 표)를시작한 다음 분석 소프트웨어 내에서 "마이그레이션 영역" 파일을 엽니다.
  7. 마이그레이션 줄의 영역을 확인하려면 이미지>Adjust>임계값을 클릭합니다. 검은색 마이그레이션 영역은 빨간색으로 바뀌고 백분율 영역은 임계값 상자에 표시됩니다. 이 영역은 이미지에서 캡처한 전체 영역에 비해 마이그레이션 라인이 커버하는 영역의 백분율로 보고됩니다.
  8. 마이그레이션 줄의 백분율 영역을 기록하고 이 값이 동일한 이미지에 대한 마이그레이션 셀 수와 페어링되는지 확인합니다.

7. 데이터 분석

  1. 마이그레이션셀 수를 스크래치의 백분율 영역으로 정규화합니다. 마이그레이션 셀 수를 마이그레이션 줄의 백분율 영역(#마이그레이션된 셀 % 마이그레이션 영역)으로 나눕니다. 이미지당 이 작업을 수행하며, 웰당 마이그레이션을 기반으로 평균이 아닙니다.
  2. 이미지당 값을 정규화한 후 두 이미지의 값을 추가하여 개별을 잘 나타냅니다. 이 값은 그래픽 및 통계 분석에 사용됩니다. 실험 설계에 여러 복제가 포함되어 있는 경우. 통계 분석 전에 평균 복제 값입니다.

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결과

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이 절차는 대부분의 실험실에서 비용 효율적이고 쉽게 적응할 수 있는 세포 마이그레이션을 연구하는 새로운 접근 방식을 문서화합니다. 많은 연구는 세포 이동을 평가하기 위하여 시간 경과 현미경 검사를 사용했습니다, 그러나 이 방법에 필요한 장비는 많은 실험실에서 쉽게 유효하지 않습니다. 경계에 대한 라인과 대시를 활용하면 고가의 장비를 사용하지 않고 다른 시점에서 특정 관심 영역을 탈환 할 수 있습니다(그림 1 및 도 3). 경계의 사용은이 새로운 접근 방식에 필수적이지만, 개별 연구원의 요구에 맞게 적응 할 수있는이 방법의 많은 영역이 있다. 프로토콜은 24h 끝점을 나타냈다. 그러나 개별 랩의 요구에 따라 해당 끝점을 확장할 수 있습니다. 프로토콜의 끝점을 조정하면 추가 사용을 위해 세포의 지속적인 배양이 가능합니다. 또한 이 프로토콜은 약리학적 수정자뿐만 아니라 세포외 매트릭스 기판이 마이그레이션에 미치는 영향을 테스트할...

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토론

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스크래치 마이그레이션 분석법에 대한 이 새로운 접근 법은 연구원이 세포 마이그레이션의 변화를 검사하는 데 보다 접근 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석은 다른 스크래치 분석법과 유사한 스크래치를 투여하기 위한 동일한 절차를 따르지만, 세포이동(10)의이미징 및 정확한 분석을 위한 새로운 방법을 제공한다. 이 방법은 장비 집약적인 시간 경과 현미경 검사법과 라이브 세포 이미징 챔버를 사용하는 대신 일반적으로 사용 가능한 실험실 장비의 사용을 자세히 설명합니다. 일반적인 반전 현미경 과 카메라를 활용, 하나는 일관된 문화 조건을 유지하면서 동시에 마이그레이션 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 고급 장비를 사용하지 않고 동일한 관심 영역의 정확한 이미징을 제공한다. 동일한 마이그레이션 영역을 캡처하면 셀 마이그레이션을 결정하는 불일치가 줄어들고 셀 마이그레이션을 보다 엄격하고 정확하게 측정할 수 있습니다. 마지막으로 이 메서드는 스크래치 영역을 고려합니다. 스크래치의 인간의 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 미국 육군 의학 연구 상 #81XWH-16-1-0710, 미시시피 대학 약국 및 생물 분자 과학부에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Adobe 모든 앱Adobe여기에는 이 프로토콜과 함께 사용되는 이미징 소프트웨어인 Adobe Photoshop이 포함됩니다
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterileMIDSCIAVR1
Coomassie Brilliant Blue R-250Fisher ScientificBP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 WellsFisher Scientific07-200-86
DMEM L-글루타민, 1g/L 포도당 및 피루브산 나트륨Fisher ScientificMT10014CM
Image JNIH이것은 미국 정부에서 제공하는 무료 소프트웨어이며 이 프로토콜과 함께 사용되는 분석 소프트웨어입니다
파라포름알데히드Fisher ScientificAC416785000
프리미엄 미국 유래 태아 소 혈청혁신적인 연구IFBS-HU
PrimocinInvivoGENant-pm-2이것은 심장 섬유아세포를 배양하기 위해 이 프로코톨과 함께 사용되는 항생균입니다
Zeiss Primovert MicroscopeZeiss491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 소프트웨어Zeiss소프트웨어는 카메라 구매와 함께 제공됩니다
. Tips는 AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000 를 살균하기 위해 오토클레이브됩니다..

참고문헌

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