당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 이동은 생리학적 및 병리학 적 사건의 핵심 구성 요소입니다. 면역 반응의 발달 및 장착과 같은 필수 기능에 는 정상적인 세포 이동이 필요합니다. 세포 이동 프로세스에 결함이나 변경이 발생하면 해로운 결과(즉, 암 전이, 상처 치유 및 흉터 형성)가 발생할 수 있습니다. 세포 마이그레이션의 중요성때문에, 저렴하고 적응가능하며 반복가능한 세포 마이그레이션 분석서에 접근할 필요가 있습니다. 일반적인 스크래치 마이그레이션 분석을 활용하여 일반 실험실 장비를 사용하는 세포 마이그레이션을 분석하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 설명된 방법은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고 관심있는 특정 영역을 다시 캡처 할 수있는 시각적 마커를 사용합니다. 또한, 이동 매트릭스 기판 변경에서 약리학적 수정제의 첨가에 이르기까지 실험 설계의 유연성을 제공한다. 또한 이 프로토콜은 셀 마이그레이션을 검사할 때 여러 가지 방법으로 간주되지 않는 셀 마이그레이션 영역을 설명하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 새로운 접근은 더 큰 청중에게 스크래치 이주 분석법을 제공하고 연구원이 세포 이동의 생리적 및 병리학적 영향을 검토 할 수있는 더 큰 기회를 제공 할 것입니다.
서론
세포 이동은 많은 생리학적 뿐만 아니라 병리학적 사건에 매우 중요합니다. 개발 중, 면역 반응을 장착하고, 적절한 상처 치유1,2,3이필요합니다. 이러한 세포 마이그레이션 이벤트의 대부분은 물리적 또는 화학적 신호에 의해 트리거될 수 있습니다. 예를 들어, 면역 반응 중에 백혈구는 화학 요법2에대응하여 부상 부위로 이동합니다. 또한, 백혈구는 또한 상처 치유 과정에 관여하는 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형뿐만 아니라 추가 면역 세포의 이동을 유도하기 위해 사이토카인을 방출하여 다세포 반응4를시작한다. 이동하는 세포의 능력은 적절한 생리적 기능에 필수적입니다. 그러나, 세포 이동이 확인되지 않을 때, 그것은 불리한 반응을 가질 수 있고 만성 염증, 혈관 질환, 암 전이 및손상된 상처 치유2,3,4,5,6,<....
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프로토콜
1. 일반 세포 배양
- 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)에서 1g/L 포도당을 함유한 배양 심장 섬유아세포, 나트륨 피루바테, L-글루타민, 14.2 mM NaHCO3,14.9 mM HEPES, 15% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 2 % L-글루타민, 0.02 % 항균 시약 (재료의 표참조) 및 CO2에서 유지 보수37.
- 90-95%까지 배양 심장 섬유아세포는 통로 0 (P0)에서 도달합니다. 이 시점에서 섬유아세포는 마이그레이션 분석에 사용되는 48웰 플레이트로 나눌 준비가 되어 있습니다.
2. 이주 판 준비
- 48웰 세포 배양판을 선으로 그리고, 노란색 또는 밝은 색의 영구 마커를 사용하여, 우물의 중앙 아래로 준비한다. 그런 다음, 관심의 세 가지 별도 영역으로 우물을 분할 세 해시 마크를 그립니다. 이 단면도는 화상 진찰을 위해 이용될 것입니다.
참고: 밝은 색상 영구 마커를 사용하면 마이그레이션 셀의 쉬운 이미징이 허용됩니다. 검은 색 또는 파란색과 같은 어두운 마커는 마이그레이션 셀의 시각화를 방지합니다. - 기판(예를 들어, 콜라겐)에서 의 이주를 평가하는 경우, 특....
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결과
이 절차는 대부분의 실험실에서 비용 효율적이고 쉽게 적응할 수 있는 세포 마이그레이션을 연구하는 새로운 접근 방식을 문서화합니다. 많은 연구는 세포 이동을 평가하기 위하여 시간 경과 현미경 검사를 사용했습니다, 그러나 이 방법에 필요한 장비는 많은 실험실에서 쉽게 유효하지 않습니다. 경계에 대한 라인과 대시를 활용하면 고가의 장비를 사용하지 않고 다른 시점에서 특정 관심 영역을 탈환 할 수 있습니다(그림 1 및 도 3). 경계의 사용은이 새로운 접근 방식에 필수적이지만, 개별 연구원의 요구에 맞게 적응 할 수있는이 방법의 많은 영역이 있다. 프로토콜은 24h 끝점을 나타냈다. 그러나 개별 랩의 요구에 따라 해당 끝점을 확장할 수 있습니다. 프로토콜의 끝점을 조정하면 추가 사용을 위해 세포의 지속적인 배양이 가능합니다. 또한 이 프로토콜은 약리학적 수정자뿐만 아니라 세포외 매트릭스 기판이 마이그레이션에 미치는 영향을 테스트할.......
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토론
스크래치 마이그레이션 분석법에 대한 이 새로운 접근 법은 연구원이 세포 마이그레이션의 변화를 검사하는 데 보다 접근 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석은 다른 스크래치 분석법과 유사한 스크래치를 투여하기 위한 동일한 절차를 따르지만, 세포이동(10)의이미징 및 정확한 분석을 위한 새로운 방법을 제공한다. 이 방법은 장비 집약적인 시간 경과 현미경 검사법과 라이브 세포 이미징 챔버를 사용하는 대신 일반적으로 사용 가능한 실험실 장비의 사용을 자세히 설명합니다. 일반적인 반전 현미경 과 카메라를 활용, 하나는 일관된 문화 조건을 유지하면서 동시에 마이그레이션 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 고급 장비를 사용하지 않고 동일한 관심 영역의 정확한 이미징을 제공한다. 동일한 마이그레이션 영역을 캡처하면 셀 마이그레이션을 결정하는 불일치가 줄어들고 셀 마이그레이션을 보다 엄격하고 정확하게 측정할 수 있습니다. 마지막으로 이 메서드는 스크래치 영역을 고려합니다. 스크래치의 인간의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 육군 의학 연구 상 #81XWH-16-1-0710, 미시시피 대학 약국 및 생물 분자 과학부에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Adobe 모든 앱 | Adobe | 여기에는 이 프로토콜과 함께 사용되는 이미징 소프트웨어인 Adobe Photoshop이 포함됩니다 | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM L-글루타민, 1g/L 포도당 및 피루브산 나트륨 | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | 이것은 미국 정부에서 제공하는 무료 소프트웨어이며 이 프로토콜과 함께 사용되는 분석 소프트웨어입니다 | |
| 파라포름알데히드 | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| 프리미엄 미국 유래 태아 소 혈청 | 혁신적인 연구 | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | 이것은 심장 섬유아세포를 배양하기 위해 이 프로코톨과 함께 사용되는 항생균입니다 |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 소프트웨어 | Zeiss | 소프트웨어는 카메라 구매와 함께 제공됩니다 |
참고문헌
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al.
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재인쇄 및 허가
