사이토카인 조합으로 자극된 HaCaT 세포를 사용한 건선형 피부 체외의 전사 프로필 확립

요약

본 논문은 HaCaT 세포주에 5개의 사이토카인(IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM)을 조합하여 전사 수준에서 in vitro psoriasiform 피부 염증 모델을 확립하는 방법을 제시합니다.

초록

건선은 선천면역계와 후천면역계에 의해 매개되는 흔한 만성 염증성 피부 질환으로, 표피 각질세포의 비정상적인 증식 및 분화, 염증 세포의 침투를 특징으로 합니다. 피부 특이적 각질세포는 선천면역의 핵심 구성원으로, 면역세포와 환경 자극에 반응하여 건선의 면역 발병에 중요한 역할을 합니다. 본 연구에서는 IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, 온코스타틴 M을 포함한 5가지 전염증성 사이토카인 조합(M5 combination)을 사용하여 HaCaT 세포주를 이용하여 전사 수준에서 건선각각세포의 염증을 유도하는 방법을 제시합니다. M5 조합 유도 HaCaT 세포는 항균 펩타이드(BD2, S100A7, S100A8, S100A9), 케모카인, 사이토카인(CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 및 IL-18). 각질세포 분화 마커(Keratin1, Keratin10, Filaggrin, Loricrin)의 mRNA 수치는 하향 조절되었으며, 이는 건선과 유사한 각질세포에서 파생된 전사체 데이터와 일치했습니다. 따라서 여기에 설명된 방법은 전사 수준에서 체외 건선 형태의 피부 염증을 확립하고 건선의 분자 발병 기전에 대한 연구에 기여합니다.

서론

건선은 면역 반응 조절 장애에 의해 유발되는 흔한 비전염성 만성 염증성 피부 질환으로, 표피¹을 주로 형성하는 각질세포에 영향을 미치며, 과각화증 및 부각화증을 동반한 각질세포의 비정상적으로 빠른 증식을 특징으로 합니다. 건선은 전 세계 야생 개체군의 약 3%에 영향을 미칩니다². 질병 부담은 심혈관 질환 및 대사 증후군을 포함한 여러 동반 질환에 의해 더욱 증가합니다³.

표피는 5개의 각질세포로 구성되어 있으며 분화 과정에 따라 형태학적 변화를 겪는다: 기저층(stratum basal), 스피노섬층(spinosum층), 과립층(stratum granulosum), 루시덤층(floorm lucidum, 손바닥과 발바닥에서 발견) 및 각질층(stratum corneum)은 여기에서 내표면에서 외표면으로 설명된다⁴. 표피 분화의 변화는 피부 장벽을 교란시키는데, 이는 피부 염증성 질환의 발병에 중요한 역할을 한다 5,6,7,8.

프로토콜

멸균 상태에서 1-3단계를 수행합니다. 모든 배양 배지에는 0.1mg/mL의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유되어 있습니다.

1. 세포 준비

1. 100mm 세포 배양 접시에 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 10mL에 1 x 10⁶ HaCaT 세포를 파종합니다. 배양 접시를 37°C의 가습된 5% CO₂ 배양기에서 2일 동안 배양합니다.
2. 배양액이 약 80% 농도에 도달하면 배양 접시에서 배지를 조심스럽게 제거하고 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 배양 접시를 수동으로 부드럽게 흔듭니다.
3. PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액 2mL를 세포에 첨가합니다. 용액이 세포의 단층을 완전히 코팅하도록 배양 접시를 부드럽게 흔듭니다.
4. 37°C의 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포가 위상차 현미경 검사로 배양 접시 표면에서 눈에 띄게 분리될 때까지 5분 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 세포의 형태는 둥글게 나타나야 합니다. 세포가 잘 분리되지 않....

결과

M5 조합 자극은 HaCaT 세포의 염증 반응을 유도했습니다.
HaCaT 세포를 24시간 동안 M5 사이토카인 조합 유무에 관계없이 자극했습니다.면역 및 염증성 케모카인 및 항균 펩티드의 조절에 관여하는 건선 관련 유전자의 mRNA 발현을 평가했습니다. 호중구 케모카인 CXCL1³⁸, CXCL2³⁹, CXCL8⁴⁰ 및 T 세포 케모카인 CCL20^41,42는 시간 의존적 방식으로 처리되지 않은 HaCaT 세포에 비해 M5 조합 자극 HaCaT 세포에서 유의하게 증가했다(그림 1A). 항균 펩.......

토론

본 명세서에는 5개의 사이토카인 조합(IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM)을 HaCaT 세포주에 사용하여 전사 수준에서 체외 건선 피부 염증 프로파일을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 건선 발병기전에서 유전자의 메커니즘에 대한 연구와 건선 치료 약물의 스크리닝에 적용할 수 있습니다. 최근 보고에 따르면 병변 피부에서 CD8 T 세포를 생산하는 IL-17A 및 IL22의 과발현은 건선의 발병기전에 관여한다는 것을 시사한다⁶¹. IL-1α, IL-22 및 IL-17A는 동물 모델에서 피부 염증을 유발할 수 있습니다 ^62,63,64,65. IL-17 및 IL-22<.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM— Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco 11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100139C
HaCaT cells	China Center for Type CultureCollection	GDC0106	15세대 미만
Human IL-1β ELISA Kit	Beyotime	PI305
Human IL-6 ELISA Kit	Beyotime	PI330
Human IL-8 ELISA Kit	Beyotime	PI640
IL-1 alpha Human	Prospec	CYT-253	재조합 단백질
IL-17 Human	Prospec	CYT-250	재조합 단백질
IL-22 Human	Prospec	CYT-328	재조합 단백질
OSM Human	Prospec	CYT-231	재조합 단백질
PBS	Gibco	10010049	pH 7.4
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140163
PrimeScrip RT 시약 키트	TAKARA	RR047A
TB Green Premix Ex	Taq TAKARA	RR420A
TNF alpha Human	Prospec	CYT-223	재조합 단백질
TRIzo 시약	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드	Gibco	25200072