이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.
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이 논문에서
요약
초록
상피 오가노이드 모델은 장기 시스템의 기본 생물학을 연구하고 질병 모델링을 연구하는 데 유용한 도구 역할을합니다. 오가노이드로서 성장할 때, 상피 전구 세포는 생체 내 대응물과 유사한 세포 기능을 나타내는 분화 자손을 스스로 갱신하고 생성할 수 있다. 여기에서 우리는 인간 폐에서 지역 특정 선조를 분리하고 실험 및 검증 도구로서 3D 오가노이드 배양물을 생성하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 우리는 영역 특이적 전구 세포를 분리하는 것을 목표로 폐의 근위 및 원위 영역을 정의합니다. 우리는 폐와 기관으로부터 전체 세포를 분리하기 위해 효소 및 기계적 해리의 조합을 이용했습니다. 이어서, 특정 전구 세포를 기저 세포를 분류하기 위한 NGFR 및 폐포 유형 II 세포를 분류하기 위한 HTII-280과 같은 세포 유형 특이적 표면 마커에 기초한 형광 관련 세포 분류 (FACS)를 사용하여 근위 또는 원위 기원 세포로부터 분획화하였다. 분리된 기저 또는 폐포 유형 II 전구물질을 사용하여 3D 오가노이드 배양물을 생성하였다. 원위 및 근위 선조는 모두 30 일째에 5000 세포 / 웰을 도금 할 때 원위 영역에서 9-13 %, 근위 영역에서 7-10 %의 콜로니 형성 효율을 가진 오가노이드를 형성했습니다. 원위 오가노이드는 배양물에서 HTII-280+ 폐포 유형 II 세포를 유지한 반면, 근위 오가노이드는 30일째까지 섬모 및 분비 세포로 분화되었다. 이러한 3D 오가노이드 배양은 폐 상피 및 상피 중간엽 상호작용의 세포 생물학을 연구하기 위한 실험 도구로서뿐만 아니라, 질병에서 상피 기능장애를 표적으로 하는 치료 전략의 개발 및 검증을 위한 실험 도구로 사용될 수 있다.
서론
인간 호흡 시스템의 공역은 크게 가스의 수송과 상피 - 미세 혈관 장벽을 가로 지르는 후속 교환을 매개하는 전도 구역과 호흡 영역으로 나눌 수 있습니다. 전도 기도에는 기관지, 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지가 포함되며 호흡기 공기 공간에는 호흡기 세기관지, 폐포관 및 폐포가 포함됩니다. 이러한 영공의 상피 라이닝은 각 기능적으로 구별되는 구역의 고유한 요구 사항을 수용하기 위해 근위축을 따라 구성이 바뀝니다. 기관지 기도의 의사 층화 상피는 브러시, 신경 내분비 및 이온성 세포 1,2,3을 포함한 덜 풍부한 세포 유형 외에도 기저, 분비 및 섬모의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. Bronchiolar 기도는 형태학적으로 유사한 상피 세포 유형을 가지고 있지만, 풍부함과 기능적 특성에는 구별이 있습니다. 예를 들어, 기저 세포는 기관지 기도 내에 덜 풍부하며, 분비 세포는 기관지-기관지 기도에서 우세한 장액성 및 잔 세포에 비해 클럽 세포의 더 큰 비율을 포함한다. 호흡 영역의 상피 세포는 폐포관 및 폐포 1,4
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프로토콜
인간의 폐 조직은 국제 의학 진흥 연구소 (IIAM)가 개발 한 동의 절차에 따라 사망 한 조직 기증자로부터 얻었으며 Cedars-Sinai Medical Center 내부 검토위원회의 승인을 받았습니다.
1. 기관지 또는 소기도/실질(소기도 및 폐포) 부위에서 폐 세포를 분리하기 위한 조직 처리
- 세포 격리 하루 전에 모든 해부 장비, 유리 제품 및 적절한 솔루션을 준비하고 오토클레이브하십시오.
- 폐 조직을 받으면 근위 및 원위 영역을 확인하고 분리하십시오. 기관과 기관지는 "근위"로 간주됩니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 기관과 기관지의 처음 2-3 세대는 해부되어 "근위"기도 상피의 분리에 사용됩니다. 직경이 2mm 이하의 작은 기도와 주변 실질 조직은 이 프로토콜의 목적을 위해 "원위" 폐 상피로 간주된다(도 1A).
참고 : 인간 폐 조직 처리와 관련된 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
2. 원위 폐 조직으로부터의 작은 기도 및 폐포 상피 전구 세포의 농축 및 하위설정
- 원위 조직 준비
- 원위 폐 조직을 ....
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결과
근원 폐 조직
기관 및 폐외 기관지 (도 1A)를 근위 기도 상피 세포의 단리와 근위 오가노이드의 후속 생성을 위한 공급원 조직으로서 사용하였다. 실질종 및 직경 2mm 미만의 작은 기도를 모두 포함하는 원위 폐 조직(도 1A)은 작은 기도 및 폐포 상피 세포(원위 폐 상피)의 단리와 작은 기도 또는 폐포 오가노이드의 생성을 위해 사용되었다. 의사층화된 상피에 의해 줄 지어 있는 근위 기도는 막 단백질 NGFR에 대해 면역반응성인 풍부한 기저 전구 세포를 포함한다(도 1B,C). 대조적으로, 폐포를 라이닝하는 상피 세포는 HTII-280 모노클로날 항체와의 정점막 면역반응성을 나타내는 하위세트를 포함하였고, 이는 그들의 폐포 유형 2 세포 (AT2) 동일성을 암시한다 (
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토론
우리는 분자 또는 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 인간 폐 조직으로부터 폐 세포의 정의 된 하위 집단을 분리하기위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 방법의 중요한 요소에는 갓 분리된 세포의 항체 매개 농축을 허용하는 표면 에피토프의 보존과 함께 조직 해리를 달성하는 능력, 및 영역 특이적 상피 오가노이드의 효율적인 생성을 위한 배양 방법의 최적화가 포함된다. 우리는 입체 배양에서 기질 지지 세포와 재결합 할 때 오가노이드를 형성 할 수있는 상피 전구 세포의 회복과 농축에 중점을 둡니다. 비록 우리가 이들 배양물에서 오가노이드의 클로날리티를 정의하지는 않았지만, 단리된 마우스 폐 상피 전구 세포를 사용하여 수행된 유사한 연구는 뚜렷한 형광 리포터를 보유하는 세포의 혼합 배양물의 사용에 기초한 것으로 나타났다22,23.
본원에 기재된 방법은 소화된 폐 조직으로부터의 세포 회.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
IFC 및 H 및 E 염색을 위한 Mizuno Takako, 조직 절편을 위한 Vanessa Garcia, 원고 준비를 도와준 Anika S Chandrasekaran의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) 및 Celgene IDEAL 컨소시엄의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 분리 | |||
| 10mL 멸균 주사기, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30mL 멸균 주사기, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| 생물학적 위험 백 | VWR | 89495-440 | |
| 생물학적 위험 백 | VWR | 89495-440 | |
| 연결 링 | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| 일회용 페트리 접시 | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| 깔때기 | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM 연구 등급 | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| 바늘 16G | VWR | 305198 | |
| 바늘 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µ m (세포 여과기) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µ m (세포 여과기) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µ m (세포 여과기) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µ m (세포 스트레이너) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µ m (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| 면도날 | VWR | 55411-050 | |
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| 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS -G) (100X) | ThermoFisher 과학 | 41400045 | 500 µ l |
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| SB431542 TGF-β 경로 억제제 (재고 100 mM) | 줄기 세포 | 72234 | 5 µ l |
| 에 대한 항체 목록 | |||
| , 구연산 기반 | 벡터 | H-3300 | 937 &마이크로; l 100ml 물에서 |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| 기본 항체 | |||
| 안티 HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 단클론 항체 (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| 인간 자궁 색소 / SCGB1A1 항체 | R 및 D 시스템 | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken 항체, 정제 [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC 단클론 항체 (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin 항체 (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 항체 | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| 2차 항체 | |||
| 당나귀 anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
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| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| 염소 안티-마우스 IgG1 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| 염소 안티-마우스 IgG2a 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| 염소 안티-마우스 IgG2a 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| 염소 항 마우스 IgG2b 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| 완충액 | |||
| 면역조직화학 차단 용액 | 3% BSA, TBS의 o.4% Triton-x100(Tris 기반 식염수) | ||
| 면역조직화학 배양 용액 | 3% BSA, TBS | ||
| 의 .1% Triton-X100면역조직화학 세척 용액 | TBS 0.1% 트윈 20 |
참고문헌
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.
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