RNA-seq 기반 퓨린 뉴클레오시다아제의 유전자 채굴 및 염기서열 분석

요약

본 프로토콜에서는 RNA-Seq를 기반으로 한 퓨린 뉴클레오시다아제(PN, EC:3.2.2.1)의 유전자 채굴 및 염기서열 분석 방법을 설명하였다. PN의 독특한 2차 및 3차 구조를 보여주기 위해 ProtProm 분석이 적용되었습니다. 또한, RNA-Seq 결과의 신뢰성을 검증하기 위해 전사체에서 PN 유전자를 복제했습니다.

초록

애벌레 곰팡이(Ophiocordyceps sinensis)는 가장 가치 있는 곰팡이 중국 전통 의학(TCM) 중 하나이며 아데노신과 같은 활성 성분을 많이 함유하고 있습니다. 아데노신은 다양한 항종양 및 면역 조절 활성을 가진 생물학적으로 효과적인 성분으로 간주됩니다. 아데노신 생합성에서 퓨린 뉴클레오시다아제(PN)의 기전을 더욱 규명하기 위해 PN을 암호화하는 유전자를 성공적으로 채굴하고 애벌레 곰팡이의 RNA-Seq 데이터베이스를 기반으로 추가 분석했습니다. PN 의 전장 cDNA는 855bp였으며, 이는 284개의 아미노산을 암호화했습니다. BLAST 분석은 NCBI에서 뉴클레오시드 가수분해효소와 85.06%의 가장 높은 상동성을 보여주었습니다. ProtProm 분석은 상대 분자량이 30.69kDa이고 등전점이 11.55임을 보여주었습니다. PN의 2차 구조는 Predict Protein에 의해 예측되었습니다. 그 결과, 알파나선 구조가 28.17%, 스트랜드 구조가 11.97%, 루프 구조가 59.86%를 차지하는 것으로 나타났다. 또한, PN 유전자는 전사체로부터 추가로 복제되고 검증을 위해 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출되었습니다. 이 연구는 진균 TCM에서 아데노신 생합성의 유전적 조절에 대한 보다 충분한 과학적 근거와 새로운 아이디어를 제공합니다.

서론

곰팡이 중국 전통 의학(TCM)은 풍부한 종 자원을 가지고 있습니다 ^1,2. 애벌레 곰팡이(Ophiocordyceps sinensis)는 잘 알려진 곰팡이 TCM이며 혁신적인 약물의 공급원으로 간주됩니다 ^3,4. 애벌레 곰팡이는 중국 남서부의 티베트 고원에서 발견되는 벌레와 곰팡이가 결합된 혼합물로, Hirsutella sinensis는 애벌레 몸에 기생합니다⁵. 현재 H. sinensis는 분자 및 형태 생물학 증거 ^6,7에 따라 애벌레 곰팡이의 유일한 아나모프로 보고되었으며, 야생 애벌레 곰팡이⁸에 비해 관련 독성이 적고 유사한 임상 효능이 있습니다. H. sinensis는 뉴클레오시드, 다당류 및 에르고스테롤과 같은 다양한 생물학적으로 효과적인 성분을 보유하고 있으며 ....

프로토콜

참고: 애벌레 곰팡이(H. sinensis)의 아나모프 균주가 우리 실험실에 기탁되었습니다. 대장균 DH5는 베이징 중의과대학 선전시(Shenzhen Hospital)에 의해 보존되었습니다.

1. RNA-Seq 준비

1. 균사체의 수확
   1. H. sinensis의 발효를 위한 발효 배지를 준비합니다: 분말 옥수수 가루(1%), 누에 번데기(1.5%), 효모 추출물(0.5%), 트립톤(1%), 포도당(1.5%), 밀기울(1.5%), 덱스트린(0.5%), KH₂PO₄ (0.02%) 및 MgSO₄ (0.01%).
   2. 스케일업 배양을 위해 10% 발효 배지로 접종을 준비합니다(100mL 배지당 10mL 배지 추가). 16 °C의 조건으로 150 rpm의 회전 쉐이커에서 10 일 동안 침수 발효를 실시합니다.
   3. 무성 생식은 10 일 동안 애벌레 곰팡이의 anamorph의 균사체를 수확합니다. 발효된 배지를 원심분리하고 원심분리 후 상등액을 버립니다. 초순수 100mL를 3회 첨가하여 균사체를 현탁시키고 원심분리로 상층액을 제....

결과

PN 유전자의 ORF 염기서열은 길이가 855bp였으며, 이는 30.69kDa의 계산된 분자량과 11.55의 예측 등전점을 가진 284개의 아미노산을 암호화하여 PN이 알칼리성 단백질임을 나타냅니다. 신호 펩타이드를 식별하기 위해 SignalP4.0 서버를 적용했으며, 그 결과 PN에는 신호 펩타이드가 없는 것으로 나타났습니다. 또한, BLASTP 검색 결과에 따르면 애벌레 곰팡이에서 유래한 PN은 Purpureocillium lilacinum (OAQ81830.1)의 뉴클레오시드 가수분해효소와 가장 높은 동일성(85.06%, E 값 = 1e-88)을 공유했습니다. 또한, PN의 다중 염기서열 정렬을 수행하기 위해 ClustalX 프로그램을 적용했으며, 그 결과는 그림 1에 나타나 있으며, 11-166개의 아미노산이 이노신/우리딘 가수분해효소 도메인의 보존된 아미노산 서열임을 밝혔습니다. 그 후, 계통발생 나무의 결과는 애벌레 .......

토론

인간의 건강은 종양, 심혈관 및 뇌혈관 질환과 같은 일련의 주요 의학적 문제에 직면해 있습니다^26,27. TCM은 풍부한 종 자원과 활성 성분의 다양한 구조 및 기능으로 인해 혁신적인 의학의 연구 및 개발의 원천으로 간주되어 왔습니다^28,29. 애벌레 곰팡이는 나비목의 유충에 있는 곰팡이 기생충이며 중국 전통에 활력을 불어넣는 식물이며 Panax 및 Pilose 뿔과 함께 최고의 활력 물질 중 하나로 간주됩니다³⁰. 아데노신, 스테롤, 뉴클레오시드, 테르펜 및 펩티드와 같은 다양한 활성 성분을 TCM^29,31에서 추.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNase-free DNase I	TaKaRa	2270B
PolyATtract mRNA 분리 시스템	Promega	III
랜덤 헥사머 프라이머	Thermo Scientific	SO142
NEBNext1 Ultra RNA 라이브러리 준비 키트	NEB	E7530S
PCR 추출 키트	QiaQuick
Agarose	TransGen Biotech	GS201-01
High-throughput sequencer	Illumina	HiSeq™ 4,000
LTF Viewer	LTF	V5.2
ORF 프로그램	NCBI
ProtParam tool	SIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP Server	DTU Health Tech	5.0
BLAST	NCBI
Clustal X 프로그램	UCD 더블린
MEGA	진화 의학 및 정보학 센터	4.0
InterProScan	유럽 분자 생물학 연구소
단백질	예측 뮌헨
WISS-MODEL	스위스 생물 정보학		연구소
Primer Express	Applied Biosystems	3.0
EcoRI	NEB	R0101V
NotI	NEB	ER0591
pMD18-T Vector	TaKaRa	6011
아가로스	Sigma-Aldrich	GS201-01
Trans2K® 플러스 II DNA 마커	시그마-알드리치	BM121-01
6× DNA 로딩 버퍼	Sigma-Aldrich	GH101-01
GelStain	Sigma-Aldrich	GS101-02
50 x	TAE Sigma-Aldrich	T1060
겔 이미징 분석 시스템	Syngene	G:BOX F3
E. coli JM109	Promega
T4 DNA ligase	EarthOx	BE004A-02
pPIC9K	겐로치	GP0983

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