쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰

요약

여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

초록

순진한 림프구는 생리적인 조건 하에서 림프구에 혈액에서 재순환하고 일반적으로 창 자 면역에 중요 한 현상으로 인식. Peyer의 패치 (PPs) 또는 막질 림프절과 같은 이차 림프구의 기질은 순진한 림프구가 항원을 감지하는 곳입니다. 순진한 림프구는 높은 내피 정맥, PPs에 입력의 포털에 도달하기 위해 혈류를 통해 순환. 일부 면역 조절기는 림프구 이동에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 미세 순환 역학의 정밀한 평가는 매우 어렵고 생체 내에서 림프구 이동을 관찰하는 방법을 확립하는 것은 정밀한 메커니즘의 해명에 기여할 수 있다. 우리는 림프덕에서 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서 장 열대 림프구의 상세한 역학을 관찰하는 방법을 정제했습니다. 우리는 생체 내에서 쥐 P를 관찰하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 선택하고 시간 경과 사진을 사용하여 기록했습니다. 이제 림프구 역학 분석에 기여할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

서론

Peyer의 패치 (PPs)는 소장의 라미나 프로프리아에 있는 림프성 여포의 수백으로 이루어져 있습니다. PPs는 여포, 간 간 지역 및 항원 프리젠 테이션에 의해 림프구가 자극되는 여포의 하부에 위치한 발아 센터로 나뉩니다. 포신성 림프관이 없으며 항원들은 상피 세포 층을 통해 장 루멘에서 라미나 프로프리아를 침범합니다. 림프모를 포함하는 상피 영역은 모낭 관련 상피라고하며, 그 내에서 전문화된 M 세포가 점막 항원들을 섭취합니다. M 세포는 발광측과 항원으로부터 항원에서 항원에서 복용한 다음 수지상 세포에 의해 포획되고 높은 내피 정맥(HEV)의 내피성 정맥을 통해 PPs로 흐르는 순진한 림프구를 향해^{제시된다.} PPs는 장 면역에 있는 중요한 역할을 하고 염증의 초기 단계와 관련있습니다. 많은 분자 상호 작용은 접착 분자, 케모키인^2,3및스핑고신-1-인산염^4를포함하여 이차 림프구 기관(STO)에 림프구의 입구를 포함합니다. 따라서, 많은 예상 된 치료 대상이 있다. 따라서, PPs 내의 림프구 역학을 관찰하면 염증의 초기 단계를 엿볼 수 있으며 여러 유망한 약물의 유용성을 검사 할 수 있습니다.

여기서 방법은 여러 절차 (흉부 덕트^5로 의 통조림 및 수집 된 림프구로 주입 한 후 림프구 및 장기 관찰을 수집)를 포함하는 PPs에서 림프구의 이동에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 절차는 복잡하고 이전 보고서에서 각 절차가 수행된 방법을 정확하게 확인하기 가 어려웠기 때문에 성공적인 관찰을 달성하기 위한 몇 가지 팁을 여기에서 언급했습니다. 예를 들어, 흉부 덕트로 튜브의 캐니언은 매우 어려웠으며, 캐너레이션의 초기 성공률은 50% 미만이었습니다. 그러나, 우리는 방법을 개선하고 80 %를 초과하는 성공률을 달성했다. 우리는 여러 조건하에서 림프구의 경전 적 이동의 정량적 평가를 가능하게 하기 위하여 성공적인 관측을 위해 필요한 이 원고에 있는 몇몇 다른 팁을 언급했습니다.

이전 보고서에서는, PPs^6의혈관 구조를 얼룩지게 하기 위해 인도 잉크의 정맥 주사와 같은 시간이 지남에 따라 3차원 변화를 이해하기 어려웠다, 또는 현미경은 단일 초점^7인. 최근에는 Kaede 마우스와 같은 일부 광변환형 형광 단백질 트랜스제닉 동물을 이용한 관측 방법이 생체 내에서 체계적인 세포 움직임을 명확히^{하였다 8.} 다른 연구는 PPs^9에서림프구 송구의 CD69 독립적 인 종료를 명확히. 우리는 높은 분석 기능 때문에 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용했습니다. 이제 우리는 쉽게 고해상도 이미지를 얻고 림프구 역학을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

이 보고서에서는 PP에서 림프구 마이그레이션을 평가하는 일련의 방법을 시연했습니다. 첫째, 우리는 림프구를 수집하기 위해 흉부 덕트 캐너레이션의 세련된 방법을 보여 주었다. 둘째, 현미경 관찰하에 가능한 한 객관적인 장기를 유지하는 여러 가지 방법으로 관찰 방법을 개선하여 3시간 동안 고품질 이미지를 얻을 수 있게 했습니다. 셋째, 림프구 이동의 세포 움직임을 정량화하여 일부 약물의 효과를 평가했습니다. 이러한 수정된 프로토콜은 점막 면역학 평가의 발달에 기여할 것입니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 국방 의과 대학의 동물 연구위원회 (No. 16058)에 의해 승인되었다. 동물은 표준 실험실 차우 (CLEA Japan Inc., 도쿄, 일본)에 유지되었습니다. 실험실 동물은 건강의 국가 학회 지침에 따라 취급되었습니다.

1. 림프구의 수집 및 분리

참고: 림프구는 신선해야 하고 저장할 수 없으므로 각 실험에 대해 쥐에서 수집해야 합니다. 또한, 창 자-열대 림프 구체는 순환 흉부 덕트에서 직접 수집 해야 합니다. 모든 절차는 6시간 이내에 완료될 것으로 예상되며 모든 계측기, 장갑 및 표면은 깨끗합니다. 동물을 생리적으로 안정된 상태로 유지하기 위해서는 실험에 사용되는 모든 식염수 및 기타 유체를 따뜻하게 유지해야 합니다.

1. 뜨거운 물(약 80~90°C)에 담근 후 헤파린 곡선(반경 약 5mm)과 같은 캐너레이션 튜브(1mm 직경)를 형성하고 몇 시간 전에 접착제 테이프를 사용하여 플라스틱 보드에 고정합니다.
2. 미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 남성 위스타 쥐(8-12주)를 마취시키고 모발 클리퍼를 사용하여 복부의 체모를 자른다. 모발이 복강에 들어가지 않도록 면도 후 모발을 단단히 제거합니다.
3. 절차에 필요한 마취의 안정적인 깊이가 발가락 핀치에 의해 얻어진다는 것을 확인한 후, 중간선에서 왼쪽 하위 부위까지 수평으로 수술 가위를 절개합니다. 경상부 혈관을 보면서 정수리 성 관음의 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.
4. 젖은 거즈로 위를 감싸고 위장을 몸 의 오른쪽 바깥쪽으로 부드럽게 움직여 회복 기관을 드러냅니다. 척추의 발기 근육과 수술 가위를 사용하여 지방 조직 사이에 노치를 삽입하고 손가락으로 무뚝뚝하게 분리하십시오.
5. 흉부 덕트 주변의 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 과잉 결합 조직은 나이에 따라 증가합니다. 흉부 덕트의 길이가 20mm까지 소뚜럼의 왼쪽 십자군 바로 아래에서 흉부 덕트를 노출시합니다. 정밀 핀셋 또는 습식 면 면봉을 사용하여 흉부 덕트와 대어 사이에 부드럽게 접착력을 분리합니다.
   1. 일부 쥐는 심혈 신경총의 높은 위치 (거미줄처럼 확산 작은 흉부 덕트)의 높은 위치로 인해 흉부 덕트 또는 짧은 흉부 덕트를 통해 교차 복부 동맥에서 분기 동맥이 있기 때문에 신중하게이 과정을 수행. 부종을 유도하지 않으려면 흉부 덕트에 불필요한 접촉을 피하십시오.
6. 다이어프램의 왼쪽 십자군 바로 아래에 있는 흉부 덕트에 스트링(3-0 실크)으로 합자를 적용합니다. caudal 흉부 덕트가 비하됩니다.
7. 외과 가위의 절삭날을 찔러 복부 벽에 구멍(직경 5mm)을 만들고, 헤어핀 곡선 캐니밍 튜브를 통과하고, 한 지점에서 일리오피아 근육에 튜브를 리게이트합니다. 10 U/mL 헤파린을 포함하는 일반 식염수로 캐닝 튜브를 채웁니다.
8. 연재된 흉부 덕트 아래에 끈(3-0 실크)을 놓은 후, 캐뉼레이션 튜브의 날카로운 절단 가장자리로 흉부 덕트를 찌르고, 꼬리쪽으로 약 5mm를 향하게 하고, 흉부 덕트를 고정용 캐뉼레이션 튜브로 리게이트한다.
9. 탈수를 방지하기 위해 식염수를 공급하려면 정밀 핀셋을 사용하여 위 안트럼의 전방 벽에 구멍 (직경 3mm)을 만들고 실리콘 튜브 (직경 2mm)를 유로 반지를 통해 십이지장에게 전달합니다. 상처를 바느질하고 Bollman의 케이지에서 동물을 유지 한 후, 3 mL / h의 유속으로 실리콘 튜브에서 각 쥐의 십이지장에 설탕이 함유 된 식염수를 주입하기 시작합니다. 케이지 전체를 종이 타월로 덮어 따뜻하게 유지합니다.
10. 6 U/mL 헤파린, 10% 태아 소 혈청, RPMI 1640 배지(pH 7.4; 재료 표 참조)를 포함하는 얼음에 50mL 원추형 튜브의 뚜껑의 중앙에 있는 구멍에 캐닝 튜브를 고정하고, 얼음에 흉부 덕트 림프구(TDL)를 수집한다. 튜브 내부의 피브린 응고 형성으로 인한 칸누라기 튜브 폐색을 방지하기 위해 원문 관의 벽에 튜브의 끝을 접촉하지 않도록주의하십시오. 림프액(약 20mL)은 약 1.0x 10 8~109림프구를 6시간 안에 얻을 수 있다. 완전한 마취 하에 림프구를 얻기 위해 마취 평면을 모니터링하고 림프 흐름이 적절하게 관찰됩니다. 동일한 마취제는 쥐가 6 시간 동안 지속적으로 깊은 마취를 얻기 위해 발만의 케이지에 넣은 후 약 3 시간 동안 동일한 용량으로 첨가됩니다.

2. 카복시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDSE)와 림프구 라벨

1. 디메틸 설프산화물(DMSO)에서 15.6mM(500μg의 CFDSE가 DMSO의 60 μL로 용해됨)에 CFDSE(재료표)를 용해한다.
2. ^RPMI1640의 50mL에서 37°C에서 37°C에서 30분 동안 30분 동안 림프구(1 x 10⁸~10^9)를배양한다.

3. 미세 혈관 연구를위한 실험 용 설정

1. 미다졸람(2mg/kg), 도미토르(0.15mg/kg), 베툴파르(2.5mg/kg)의 혼합물을 관성 주사로 주사하고 발가락 핀치에 의한 마취 깊이를 확인한다. 모발 오염을 최소화하기 위해 모피를 손질하기 전에 복부를 적십니다. 그런 다음 중간 절개를 통해 받는 위스터 쥐의 복부를 엽니다.
2. 휴대용 스테인리스 스틸 플레이트(약 120 x 300mm)에 쥐를 놓고 중앙 주변에 직사각형 구멍이 유리 슬라이드(24 x 50mm)로 덮여 있습니다. 관찰을 위해 PP를 포함하여 일체 세그먼트의 약 10cm를 선택합니다.
3. 내장을 가능한 한 따뜻하게 유지하고 인산완충식염(PBS)을 37°C로 데워 보세요. PBS로 소장을 커버하는 데 사용되는 거즈를 담그십시오.
4. 2 % 이소플루란 (재료의 표 참조)와 연속 마취를 제공하면서, 현미경의 단계에 슬라이드를 넣어 일부 HEV가 세로사를 통해 실행되는 PP에서 미세 순환의 관찰에 적합한 영역을 선택합니다. P의 크기; 더 큰 것들은 CLSM을 사용하여 미세 순환의 관찰에 적합합니다. 소장은 장소에서 똑바로 하지 않습니다. 장력 없이 길이가 2cm 이상 인 직선 세그먼트는 관찰에 적합합니다.
5. PBS에 담근 흡수성 면으로 인접한 장 세그먼트와 장간을 덮습니다. 내장 세그먼트를 두 개의 압연 면공 사이에 놓고 쥐의 심장 박동과 호흡에 의해 진동되는 것을 방지하기 위해 쥐의 몸에서 가능한 한 멀리 배치합니다.
6. 1 mL 주사기를 사용하여, 천천히 주입 (이상 1 분) CFSE 라벨 TDL (1 x 10⁸ 세포) 받는 사람 쥐의 경정맥에. 급속한 정맥 주사는 전신 순환에 영향을 미칠 수 있습니다.

4. 림프구의 미세 순환

1. CLSM을 사용하여 PPs의 미세 혈관에서 TDL을 지속적으로 모니터링하고 30대 간격으로 타임랩스 사진을 사용하여 3시간 동안 컴퓨터에 기록합니다. PP의 HEV에 세로사에서 깊이는 약 25 μm, 30 μm의 깊이에 스트로마와 모세관 림프관의 관찰을 가능하게.
2. 텍사스 레드-dextran (25 mg/kg)을 각 수신자 쥐의 경정맥에 주입하여 혈류를 얼룩지게 하고 Hoechest 33342 (5 mg/kg)를 세포 핵을 얼룩지게합니다.
3. (선택 사항) 림프구 역학을 정량화하기 위해 30초 이상 HEV에 대한 림프구를 "접착제 림프구"로 정의하고 HEV에서 기마로 이동하는 림프구를 '이동 림프구'로 정의합니다. 그런 다음 시야당 이동(림프구/접착제 림프구 마이그레이션 + 림프구 마이그레이션)의 평균 백분율을 계산합니다(약 0.3 mm^2).

결과

림프에서 림프구 수집
흉부 덕트 캐넌션에 대한 쥐를 준비하려면 도 1에 표시된 것처럼 긴장된 흉부 덕트에서 절개를 한 다음 도 2에표시된 볼만의 케이지에서 쥐를 유지한다.

림프구가 잘 수집되면 약 20mL/6 h 림프액을 약 10 7~108/mL 림프구를 얻을 수 있습니다. TL 중 70%는 CD4를 발현하며, 그 중 약 90%의 세포가 CD62L을 발현하며, 이는 TDL의 주요 구성(>60%)을 의미합니다. 순진한 창 자-열대 림프구로 구성. 여기서 수집된 림프구는 특히 장내로 이동하는 세포이기 때문에 Peyer의 패치에서 마이그레이션 상태를 평가하기에 적합합니다.

현미경 관찰
형광 림프구의 적절한 복용량을 ...

토론

여기에서 우리는 순진한 창자 열대 림프구를 수집하고 쥐 PPs에서그들의 이주를 관찰하기위한 프로토콜을 설명했다. 이 절차는 림프구가 PPs의 microvasculature에서 어떻게 움직이는지 밝히고 정상 또는 약용 조건하에서 그들의 역학을 시각적으로 비교하는 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 역학의 직접적인 관찰은 관측 기간이 불과 몇 시간으로 제한되지만 일부 약물에 의한 면역 학적 수정에 대한 단서를 얻는 데 많은 장점이 있습니다.

우리는 방법에 몇 가지 팁을 언급했다. 그 중 에서도 가장 섬세한 절차 중 하나는 작업자가 흉부 덕트를 빠르고 정확하게 캐너레이트할 수 있어야 한다는 것입니다. 수술이 오랜 시간이 걸리고 불필요한 손상을 수반하는 경우, 상당한 출혈과 염증이 발생하여 결합 조직의 부종과 흉부 덕트의 방해로 인해 TDL 수집이 감소합니다. 우리는 작은 최첨단가있는 가위를 사용하여 흉부 덕트에 작은 절개를 한 후 튜브를 캐너레이트하는 데 사용했습니다. 그러나, 이 절차...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical	Industries 099-06571
RPMI 1640 매체	GIBCO	11875093
텍사스 레드– 덱스트란	써모 피셔 사이언티픽	D1863