제노이식 모델의 혈액에서 순환 돼지 특이적 DNA의 정량화

Summary

이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 정량화되었다.

Abstract

제노이식은 장기 부전을 치료하는 실현 가능한 방법입니다. 그러나, xeno이식의 면역 거부를 효과적으로 감시하는 방법은 의사와 연구원을 위한 문제입니다. 이 원고는 돼지 대 마우스 세포 이식 모델 및 돼지 - 투 - 원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 효과적인 방법을 설명합니다. 순환 DNA는 장기 손상을 위한 잠재적으로 비침습적인 바이오마커입니다. 이 연구에서는, 순환돼지 특이적 DNA(cpsDNA)는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 제노이식 거부 중에 모니터링되었다. 이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. 종별 프라이머는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 가치는 xeno이식의 면역 거부를 모니터링하기 위해 간단하고 편리하며 저렴한 비용 및 덜 침습적 인 방법으로 사용될 수 있음을 시사합니다.

Introduction

장기 실패는^사망1의 주요 원인 중 하나입니다. 세포, 조직 및 장기의 이식은 장기 부전^2를치료하는 효과적인 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 기증자 기관의 부족은 이 방법의 임상 적용을^제한3,4. 연구 결과에 따르면 돼지는 임상^이식을위한 인간 장기의 잠재적 인 원천으로 사용될 수 있음을 보여 주었다^5,6. 그러나, 종 간 장기 이식은 위험한 면역 거부에 직면. 따라서, xeno 이식의 면역 거부를 모니터링 하는 것이 중요 하다. 현재 면역 거부의 임상 모니터링은 주로 환자의 징후와 증상뿐만 아니라 실험실 테스트 (예를 들어, 생검, 면역 생화학 적 분석 및 초음파)^7,8,9에의존한다. 그러나 이러한 모니터링 방법에는 많은 단점이 있습니다. 환자에 있는 면역 거부의 표시 그리고 현상은 일반적으로 조기 발견 및 조기 내정간섭에 도움이 되지 ....

Protocol

모든 실험은 심천대학교 제1부산병원의 심천제병원 기관심사위원회의 관련 지침및 규정에 따라 수행되었다.

1. 디자인 돼지 특정 프라이머

1. 소프트웨어 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 인간, 원숭이 또는 마우스의 유전자와 다른 돼지 특정 유전자를 식별하기 위해 전체 게놈 BLAST 분석을 수행합니다.
2. 프라이머 5의 소프트웨어를 사용하여 19개의 돼지 특이유전자(표 1)에따른 설계 프라이머.

2. 게놈 DNA 격리

참고: 게놈 DNA(돼지, 원숭이, 자원 봉사 인간, 돼지 이식편을 가진 원숭이, 돼지 세포를 가진 마우스 등)는 상업적게놈 DNA 추출키트(재료표)를사용하여 추출하였다.

1. 위의 시료의 전체 혈액 의 500 μL을 각각 다른 미세 원심 분리 튜브에 놓습니다.
2. 위의 미세 원심 분리기 튜브에 프로테아제 K 20 μL과 500 μL의 용액 버퍼를 추가한 다음 철저히 흔들고 섞습니다.
3. 이러한 미세원심분리기 튜브를 56°C의 수조에 넣고 10분 동안 이 과정에서 2-....

Results

본 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 플라스미드 함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다(도4). 19프라이머의 종 특이성은 PCR에 의해 확인되었다. 종별 프라이머(프라이머 #4 및 프라이머 #11)는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다.

아가로스 전기포광은 위의 샘플에서 증폭된 DNA 단편을 분리하는 데 사용되었으며, 이는 자외선 심조에서 시각화됩니다. PCR을 사용하여, 증폭된 돼지 게놈 DNA에 특이적인 프라이머가 먼저확인되었다(도 2A). 또한, 원숭이/인간 게놈의 코호트 또는 마우스 게놈 DNA의 코호트에서 돼지 DNA를 구체적으로 증폭시킨 이들 프라이머의 특정 종 특이성이확인되었다(.......

Discussion

발신 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 감시하는 실행 가능한 접근법을 나타냅니다. Gadi^{외. 24} 급성 거부 환자의 혈액에서 기증자 유래 순환 DNA (ddcfDNA) 함량은 거부없이 환자의 함량이 상당히 높다는 것을 발견했다. 이 연구 결과는 ddcfDNA가 기관 이식 손상을 감시하기 위한 일반적인 biomarker일 지도 모르다는 것을 건의합니다. 최근에는 간단한 작동, 높은 수준의 자동화, 높은 민감도, 좋은 특이성 및 저비용 때문에 qPCR이 핵산 분석에 점점 더 많이 적용되고 있다.

이 연구에서, 돼지 특정 프라이머는 생물 정보학 분석의 결과에 따라 설계되었습니다. 그들의 특이성은 일반 PCR에 의해 확인되었습니다. 돼지-원숭이 동맥 패치 모델및 돼지-마우스 세포 이식 모델의 혈액 샘플의 cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 정확하게 정량화될 수 있다. 접근 방식.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest, 바르셀로나, 스페인	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	R3136S
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Axygen  Biosciences, Union City, CA, USA	MCT-150-C
0.2 mL PCR 튜브	Axygen  Biosciences, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL/6	광동성 생쥐 의료 동물 센터,  중국		8~10주
원심분리기	열  어부  과학, 월햄, 매사추세츠, 미국	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1– 10.0kb
마커 I	Tiangen, 베이징, 중국	MD101-02	0.1– 0.6 kb
DNA 미니 컬럼(HiBind DNA 미니 컬럼)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA 로딩 버퍼	Solarbio, 베이징, 중국	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I 및 E.Z.N.A. 플라스미드 DNA 미니 키트 II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
D6943
EcoR I	Takara  Bio, 일본 시가&	nbsp; 1040S
암컷 Bama 미니 돼지	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2 ~ 4 개월
게놈 DNA 추출 키트?	Tiangen, Beijing, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japan	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
수컷 cynomolgus 원숭이	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 years
Nucleic acid dye(Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
폴리메라이제(프리믹스 Taq)	Takara  Bio, Shiga, Japan	RR901A
pMD19-T 플라스미드	Takara  Bio, Shiga, Japan	D102A
qPCR machine	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
혈청/순환 DNA 추출 키트	Tiangen, Beijing, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101