방법 논문

단백질 지형 변화의 측정을 위한 단백질의 빠른 광화학 산화에 실시간 보상 가능하게

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DOI:

10.3791/61580

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2020년 9월 1일

 , 
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

이 논문에서

요약

단백질의 빠른 광화학 산화는 단백질의 구조적 특성화를 위한 새로운 기술입니다. 다른 용매 첨가제와 리간드는 다양한 하이드록실 라디칼 청소 특성을 가지고 있습니다. 상이한 조건에서 단백질 구조를 비교하기 위해서는 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼의 실시간 보상이 반응 조건을 정상화하는 데 요구된다.

초록

단백질(FPOP)의 빠른 광화학 적 산화는 단백질의 용매 접근 표면적을 조사하는 질량 분광계 기반 구조 생물학 기술입니다. 이 기술은 하이드록실 라디칼이 자유롭게 용액에서 확산되는 아미노산 측면 사슬의 반응에 의존합니다. FPOP는 과산화수소의 레이저 광분해에 의해 이러한 라디칼을 시동하여 생성하여 마이크로초 의 순서로 고갈되는 하이드록실 라디칼의 파열을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼이 용매에 접근할 수 있는 아미노산 측 사슬과 반응할 때, 반응 제품은 질량 분광법에 의해 측정되고 정량화될 수 있는 질량 변화를 나타낸다. 아미노산의 반응 속도는 그 아미노산의 평균 용매 접근 표면에 부분적으로 의존하기 때문에, 단백질의 주어진 영역의 산화량의 측정된 변화는 서로 다른 적합성(예를 들어, 리간드 바운드 대 리간드 프리, 단백제 대 골합 등) 사이의 해당 영역의 용매 접근성의 변화와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. FPOP는 단백질 단백질 상호 작용, 단백질 형성 변화 및 단백질 리간드 결합을 포함하여 생물학에 있는 문제의 수에서 적용되었습니다. 하이드록실 라디칼의 사용 가능한 농도는 FPOP 실험에서 많은 실험 조건에 따라 다르기 때문에 단백질 해석이 노출되는 효과적인 라디칼 용량을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 모니터링은 FPOP 반응에서 신호를 측정하기 위해 인라인 도지계를 통합하여 효율적으로 달성되며, 레이저 플루온은 원하는 양의 산화를 달성하기 위해 실시간으로 조정됩니다. 이러한 보상으로, 균형성 변화, 리간드 결합 표면 및/또는 단백질 단백질 상호 작용 인터페이스를 반영하는 단백질 지형의 변화는 상대적으로 낮은 시료양을 사용하여 이질적인 샘플에서 결정될 수 있다.

서론

단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 LC-MS1에의해 검출된 단백질의 용매 노출 표면적의 초고속 공유 변형에 의한 단백질 지형 변화를 측정하기 위한 새로운 기술이다. FPOP는 과산화수소의 UV 레이저 플래시 광분해에 의해 시상에서 고농도의 하이드록실 라디칼을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼은 매우 반응적이고 수명이 짧으며, FPOP 조건2하에서대략 마이크로초 단위로 소비된다. 이러한 하이드록실 라디칼은 물을 통해 확산되고 일반적으로 빠른(~106M -1 s-1)에서확산제어3에이르는 운동 속도로 용액의 다양한 유기 성분을 산화한다. 하이드록실 라디칼이 단백질 표면을 만날 때, 라디칼은 단백질 표면의 아미노산 측망을 산화시켜 그 아미노산의 질량 이동(가장 일반적으로 하나의 산소 원자의 순첨가)을 생성한다. 어떤 아미노산에서 산화 반응의 속도는 두 가지 요인에 따라 달라집니다: 그 아미노산의 고유 반응 (사이드 체인 및 서열 컨텍스트에 따라 달라집니다)4,,5 및 확산 하이드록실 라디칼에 그 측 체인의 접근성, 이는 밀접하게 평균 용매 접근 표면적 6에 상관 관계6,,7. 글리신을 제외한 모든 표준 아미노산은 FPOP 실험에서 이러한 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 표지된 것으로 관찰되었지만, 이는 널리 다른 수율에도 불구하고; 실제로, Ser, Thr, Asn 및 Ala는 고라디칼 복용량을 제외하고 대부분의 샘플에서 산화된 것으로 거의 보이며 신중하고 민감한 표적 ETD 단편화8,,9에의해 식별됩니다. 산화 후, 시료는 과산화수소 및 이차 산화제 (슈퍼 산화물, 단일 산소, 펩디딜 하이드로퍼산화물 등)를 제거하기 위해 담금질됩니다. 담금질된 시료는 산화 펩티드의 혼합물을 생성하기 위해 프로테오틸리로 소화되며, 여기서 구조 정보는 다양한 펩티드의 산화 제품의 패턴에서 화학적 "스냅샷"으로 동결된다(도1). 질량 분석법(LC-MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 해당 펩타이드의 산화 및 산화되지 않은 버전의 상대적 강도에 기초하여 주어진 프로테오리틱 펩타이드에서 아미노산의 산화량을 측정하는 데 사용된다. 상이한 형태 조건하에서 수득된 동일한 단백질의 이러한 산화 발자국(예를 들어, 리간드-바운드 대 리간드 프리)을 비교함으로써, 단백질의 주어진 부위의 산화량의 차이는 해당6영역6,7의용매 접근 표면적의 차이와 직접 상관관계가 있을 수 있다. 단백질 지형 정보를 제공하는 능력은 FPOP단백질 치료 발견 및개발(10,,11)을포함한 단백질의 고차 구조 측정을 위한 매력적인 기술이다.

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그림 1: FPOP 개요입니다. 단백질의 표면은 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 공유적으로 변형됩니다. 하이드록실 라디칼은 측면 사슬의 용매 접근성에 의해 강하게 영향을 받는 속도로 단백질의 아미노산 측면 사슬과 반응할 것이다. 지형 변화(예를 들어, 위와 같이 리간드의 결합으로 인한)은 하이드록실 라디칼과 반응하지 않도록 상호작용 영역에서 아미노산을 보호하여 LC-MS 신호에서 수정된 펩타이드의 강도의 감소를 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FPOP 용액(예를 들어, 리간드, 부형제, 완충제)에 존재하는 상이한 성분들은 과산화수소3의레이저 광분해시에 생성된 하이드록실 라디칼을 향한 상이한 청소 활성을 갖는다. 유사하게, 과산화수소 농도의 작은 변화, 레이저 유창및 완충 조성물은 효과적인 라디칼 복용량을 변화시킬 수 있으며, 샘플 전체와 다른 실험실 사이에서 FPOP 데이터의 재생이 도전적일 수 있다. 따라서, 사용 가능한 여러 하이드록실 라디칼 도시미터,,12,13,14,15,,16중 하나를 사용하여 각 시료에서 단백질과 반응할 수 있는 하이드록실 라디칼 용량을 비교할 수 있어야 한다., 하이드록실 라디칼 도지계는 하이드록실 라디칼 풀을 위해 마취제(및 용액의 모든 청소부와 경쟁하여) 작용합니다. 하이드록실 라디칼의 유효 용량은 도시계의 산화량을 측정하여 측정됩니다. 참고 "효과적인 하이드록실 라디칼 복용량"은 유체실 라디칼의 초기 농도와 라디칼의 반감기 모두의 기능이다. 이 두 매개 변수는 부분적으로 서로 의존하여 이론적 운동 모델링이 다소 복잡합니다(그림2). 두 샘플은 여전히 형성 된 하이드록실 급진적 인 의 초기 농도를 변경하여 동일한 효과적인 급진적 인 용량을 유지하면서 격렬하게 다른 초기 급진적 인 반감기를 가질 수 있습니다; 그들은 여전히 동일한 발자국을 생성합니다(17). 아데닌13 과 트리스12 산화의 그들의 수준을 실시간으로 UV 분광기에 의해 측정 될 수 있기 때문에 편리한 하이드록실 급진적 인 도시미터, 연구원은 신속하게 효과적인 하이드록실 급진적 인 용량에 문제가있을 때 식별하고 자신의 문제를 해결 할 수 있도록. 이 문제를 해결하기 위해, 실시간으로 adenine 흡광도 변화로부터 신호를 모니터링할 수 있는 조사 현장 직후 유량 시스템에 위치한 인라인 도지계가 중요하다. 이것은 버퍼 또는 하이드록실 라디칼 청소용량(17)의광범위하게 다른 수준으로 다른 부형제에서 FPOP 실험을 수행하는 데 도움이 된다. 이러한 급진적인 복용량 보정 실시간으로 수행 될 수 있습니다., 효과적인 라 디 칼 복용량을 조정 하 여 동일한 conformer에 대 한 통계적으로 구별 할 수 있는 결과 산출.

이 프로토콜에서, 우리는 내부 광학 급진적 인 도시계로 아데닌을 사용하여 급진적 인 투여 보상과 전형적인 FPOP 실험을 수행하기위한 자세한 절차가 있습니다. 이 방법을 사용하면 조사관이 실시간으로 보상을 수행하여 용량이 다른 FPOP 조건에서 발자국을 비교할 수 있습니다.

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그림 2: dosimetry 기반 보상의 역학 시뮬레이션. 1 mM 아데닌 도시계 응답은 1mM 초기 하이드록실 라디칼 농도(▪OH t1/2=53ns)로 5 μM 리소지메 단량으로 측정되고 표적 도시계 응답(black)으로 설정한다. 폐포부부율이 1mM을 첨가하면, 체계 반응(blue)은 단백질 산화의 양과 함께 비례적 방식으로 감소(시안). 하이드록실 라디칼의 반감기도 감소합니다(▪OH t1/2=39ns). 생성된 하이드록실 라디칼의 양이 증가하여 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM 히스티딘 스캐빈거와 동일한 수율을 부여하여 1mM 하이드록실 라디칼라디칼(red)이 없는 경우, 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지는 t반면,▪2.2=ns.2=2.1=2.2.1=2.2.1μg=2.00μg.m.mm-s-29=29μg/tOH=29μg/tOH=29μg=29μg==29μg/tOH=29μg/tOH.는 수압실라디칼의 반감기 감소(nsOH=29)를 더욱 감소시키는 반면, 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM의 하이드록실 폐약량으로 달성하면 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지고 있다(2OH=29).1/2= 샤프 J.S.의 허가로 적응, Am Pharmaceut 레브 22, 50-55, 2019. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

1. 광학 벤치와 FPOP용 모세관 준비

주의: KrF 엑시머 레이저는 극도의 눈 의 위험이며, 직접 또는 반사된 빛은 영구적인 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 항상 적절한 눈 보호 기능을 착용하고, 가능한 경우 빔 경로 근처에 반사 물체가 있는지 방지하고, 엔지니어링 컨트롤을 사용하여 활성 레이저에 대한 무단 액세스를 방지하고 길 잃은 반사를 억제합니다.

  1. FPOP 옵티컬 벤치를 준비합니다.
    1. 레이저를 켜서 따뜻하게 합니다. 외부 트리거, 일정한 에너지, 가스 교체 없음으로 레이저를 설정합니다. 펄스당 레이저 에너지를 설정합니다(일반적으로 80-120 mJ/펄스 사이).
    2. 레이저 빔의 경로에 직접 평면 볼록 렌즈 (30mm Dia. x 120mm FL 코팅되지 않은)와 도 3A에표시된 빛을 흡수하는 비 반사 백스톱으로 광학 벤치를 설정합니다.

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그림 3: FPOP 실험을 위한 광학 벤치. (A)샘플은H2 O2,아데닌 라디칼 도시미터, 글루타민 청소부와 혼합되어 주사기에 적재된다.2 샘플은 KrF 엑시머 UV 레이저의 집중 빔 경로를 통해 융합 된 실리카 모세관을 통해 밀어. UV 광은 H2O2를 하이드록실 라디칼로 탈바아하여 단백질과 아데닌 도시계를 산화시합니다. 주사기 흐름은 다음 레이저 펄스 전에 레이저의 경로에서 조명 된 샘플을 밀어 내고 조명 된 영역 사이에 조명되지 않은 배제 부피를 넣습니다. 산화 직후, 샘플은 265 nm에서 아데닌의 자외선 흡광도를 측정하는 인라인 UV 분광계를 통과합니다. 샘플은 나머지 H 2O 2및 이차 산화제를 제거하기 위해 담금질 버퍼로 증착됩니다. (B)현물 크기는 248 nm에서 레이저로 모세관 뒤에 부착 된 착색 된 끈적 끈적한 노트를 조사 한 후 측정됩니다. 스팟의 폭은 시료 유량을 계산하는 데 사용되며, 스팟의 중앙에 있는 모세관의 실루엣이 광학 벤치를 정렬하는 데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 융합된 실리카 모세관(360 μm 외경 및 100 μm 내경)의 적절한 길이를 자르고 슬리브를 사용하여 낮은 사각체 커넥터를 사용하여 가스가 단단한 주사기에 연결합니다.
  2. 인라인 도지계가 샘플의 레이저 노출 후 265 nm에서 흡광도 신호를 읽는 장소에서 부탄 토치로 모세관의 폴리이미드 코팅을 부드럽게 구울 수 있습니다. 보풀이 없는 닦아내기 위에 메탄올을 사용하여 모세관의 잔해를 부드럽게 닦으십시오. 레이저 발생 부위의 폴리이미드 코팅은 부탄 토치로 유사하게 연소되거나 저전력에서 엑시머 레이저 발사로 연소될 수 있습니다.
    참고 : 뜨거운 모세관에 메탄올을 사용하는 화재 위험이기 때문에 모세관이 식을 때까지 기다립니다.
  3. 레이저의 빔 경로를 통해 인라인 도시계에이 모세관을 배치합니다.
    1. 인라인 도지계 상단의 레버를 눌러 힌지를 엽니다. 마그네틱 홀더를 제거합니다. 모세관을 인라인 도지계의 가공 된 홈에 놓고 마그네틱 홀더를 사용하여 모세관을 제자리에 유지하십시오. 모세관 위에 도지계 힌지를 닫고 레버가 제자리에 고정될 때까지 눌러 놓습니다.
  4. 도시메트리 소프트웨어를 사용하여 시작 플래시 버튼을 클릭하여 흥분 레이저를 발사합니다. 레이저 제어 소프트웨어 자체에 50-100 mJ/펄스 사이의 사전 설정된 레이저 전력을 설정하고, 도시경 소프트웨어의 설정 탭에서 10-20Hz 사이의 사전 설정 반복 속도를 설정합니다.
    1. 선형 동력 단계에 장착된 플라노 볼록 렌즈를 사용하여 레이저 빔에 초점을 맞춥니다. 도 3B에도시된 바와 같이 사고 연도(mJ/mm2)를계산하기 위해 캘리퍼를 사용하여 끈적끈적한 노트상 모세관의 위치에서 레이저 스팟의 폭과 높이를 측정한다.
  5. 렌즈의 움직임이나레이저(18)의펄스당 에너지 변화에 관계없이 모세관의 일관된 조명 폭을 보장하기 위해 모세관 근처에 불투명 조리개를 배치한다.
    1. 레이저 발사로 이동 범위를 통해 전동 스테이지를 이동합니다. 빔이 조리개 에 중심을 유지하고 모세관의 실루엣을 전체적으로 관찰 할 수 있는지 확인하십시오. 조리개 직경은 전동 단계의 범위의 모든 지점에서 임핑 집중 빔의 폭보다 작아야 합니다.
  6. 모세관을 세척하기 위해 적어도 1 분 동안 20 μL /min에서 모세관을 통해 물을 실행합니다.
    1. 도지계 소프트웨어의 시작 데이터 + AutoZero 버튼을 클릭하여 도서계를 0으로 설정하여 물을 만들고 데이터 수집을 시작합니다.
      참고: FPOP용 완충 시스템이 265nm에서 상당한 UV 흡광도를 가지고 있는 경우 FPOP 시스템은 물이 아닌 버퍼에 제로화되어야 합니다.
  7. 주사기 펌프에서 계산된 유량을 설정합니다.
    1. 단백질 샘플의 유량은 주사당 조사된 부피(VVIrr),초당 레이저 촬영수(R)및 원하는 조사되지 않은 배제 부피분획(FFEx)에따라 라미나르 유량 및 시료 확산(0.15-0.30 권장)2,,19,,20에의존한다. 다음 방정식을 사용하여 모세관의 내경(d)과 모세관(즉,d조리개 폭)에 침을 미신하는 레이저 스팟의 폭을 기준으로 VIrr(μL)을 계산합니다.w
      VIrr = π (d/2)2w
    2. 다음 방정식을 기준으로 원하는 유량(μL/min)을 계산합니다.
      흐름 = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. FPOP용 단백질 용액 제제

  1. 2개 이상의 상이한 조건에서 단백질을 준비하여(예를 들어, 리간드 바운드 및 리간드 프리; 골재 및 단조량; 단독으로 및 단백질 단백질 결합 파트너와 함께) 변형 변화를 검출한다.
  2. 실험의 요구에 맞게 FPOP에 사용되는 총 볼륨을 설정합니다. 최소 한도는 일반적으로 조사 모세관의 부피와 견고한 검출 및 상대적 정량화에 필요한 재료에 따라 달라지며, 사용되는 LC-MS/MS 시스템 및 포스트 라벨링 시료 처리 방법에 따라 크게 달라집니다. 당사 그룹에서 일반적으로 사용되는 FPOP 솔루션의 총 부피는 과산화수소를 첨가한 후 20μL입니다. 단백질의 최종 농도는 일반적으로 1-10 μM이며, 17m 글루타민 (하이드록실 라디칼의 수명을 제한하기 위해), 1 mM 아데닌 (급진적 인 도시계로 작용함)13,,17 및 10 mMM 인산염 버퍼 (하이드록실 라디칼의 가난한 소캐빈거). 샘플은 일반적으로 결과의 통계 모델링을 허용하기 위해 여러 복제로 준비됩니다.
    1. 대부분의 일반적인 목적을 위해, 두 주에서 트리플리케이트에 샘플을 준비, 플러스 배경 산화를 측정하기 위해 노 레이저 제어로 사용하는 적어도 하나의 샘플. 이 FPOP 솔루션 믹스의 18 μL을 준비합니다.
      참고: 생화학에 일반적으로 사용되는 많은 완충제와 첨가제는 하이드록실 라디칼 청소부입니다. 이러한 첨가제 및 버퍼를 사용할 수 있습니다. 그러나, 버퍼의 하이드록실 라디칼 청소로 인한 산화의 감소가 발생할 수 있다. 일반적으로, 단백질 산화 수율을 최대화하기 위해 생물학적 시스템에 필요한 최소한정에 모든 첨가제를 보관하십시오. 디메틸 설옥산화물은 이차 래디칼을 생성하는 성향 때문에 피해야 한다; 디메틸포르마미드는 우리 손에 유용한 대안이 되었습니다. 강력한 하이드록실 라디칼 청소부인 버퍼를 사용하는 경우 글루타민은 종종 FPOP 솔루션 믹스에서 제외될 수 있습니다.
  3. FPOP 실험 직전에 과산화수소 1M을 준비합니다.
    참고: 공급 업체가 일반적으로 판매하는 과산화수소 의 30 %는 유통 기한을 증가 시키는 안정제가 포함되어 있습니다. 희석되면 과산화수소는 같은 날 에 빠르게 사용해야합니다. 과산화수소는 또한 하이드록실 라디칼 도지미터를 사용하여 FPOP에 의해 분해를 정기적으로 테스트해야 합니다.
  4. 메티오닌 아마이드의 0.5 μg/μL 및 0.5 μg/μL 카탈라제의 담금질 용액 25 μL을 포함하는 마이크로센심심분리기 튜브를 준비하십시오. FPOP에 20μL보다 큰 샘플 부피가 사용되는 경우 담금질 용액 볼륨을 비례적으로 늘립니다.

3. FPOP 실험 수행

  1. FPOP 용액 믹스의 18 μL에 과산화수소 2 μL을 추가합니다. 내용내용을 파이펫과 부드럽게 섞고 용액을 미세원심분리기 튜브 바닥으로 빠르게 회전시합니다. 즉시 가스가 단단한 주사기로 수집하고 주사기 펌프에 적재하십시오.
  2. 도시계 소프트웨어의 시작 펌프 버튼을 클릭하여 1.8.1 단계(일반적으로 8-16 μL/min 사이)에서 결정된 유량으로 주사기 펌프의 흐름을 시작합니다.
  3. 인라인 도지계(재료표참조)를 사용하여 실시간 아데닌 판독값을 모니터링하고 샘플을 폐기물로 수집합니다. Abs265 신호가 안정화될 때까지 기다립니다.
  4. 측정기 소프트웨어의 시작 플래시 버튼을 클릭하여 사전 설정된 반복 속도와 에너지로 레이저를 발사합니다.
  5. 인라인 측정값을 사용하여 실시간 아데닌 판독값을 모니터링합니다(재료 표참조); 레이저끄기와 레이저가 켜진 Abs265의 차이는 ΔAbs265 판독값입니다.
    참고: 과산화수소가 있는 레이저를 발사할 때 매우 불안정한 Abs265 판독값의 출현은 용액의 거품 생성에 기인합니다. 레이저의 연도를 감소 및 /또는 과산화수소의 농도는 거품을 제거합니다.

4. 보상 수행

참고: 다른 리간드, 버퍼 등은 하이드록실 라디칼을 향한 다른 청소 능력을 가질 수 있다. 유사한 효과적인 하이드록실 라디칼 복용량이 다른 샘플에 걸쳐 단백질과 반응할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 이는 샘플 간의 동일한 하이드록실 라디칼 도지계 응답을 보장함으로써 수행됩니다. 아데닌 도시메트리를 사용하여, 265nm(ΔAbs265)에서UV 흡광도의 변화는 효과적인 하이드록실 라디칼 용량을 반영한다; ΔAbs265가클수록 효과적인 하이드록실 라디칼 용량이 높아지다.

  1. 사전 실험 또는 컨트롤에 의해 얻어진 원하는 ΔAbs265 판독값과 인라인 도시계로 얻은 ΔAbs265 판독값을 비교한다. ΔAbs265 원하는 판독값보다 낮은 판독은 하이드록실 라디칼의 불충분한 유효 용량을 나타낸다; ΔAbs265 판독값은 너무 높은 효과적인 라디칼 용량을 나타냅니다. ΔAbs265 판독값이 원하는 수준에 있는 경우, 담금질버퍼(17)에서레이저 조사 직후 샘플을 수집한다.
  2. ΔAbs265를균등화하기 위해 효과적인 라디칼 용량을 보상한다. 이 보상은 과산화수소 농도를 변화시키고, 펄스당 레이저 에너지를 변화시킴으로써 레이저 유동을 증가하거나, 초점 렌즈의 초점 평면을 변경하여 레이저 유동성을 증가시키는 세 가지 방법으로 수행될 수 있다.
    1. ΔAbs265 판독값에서 큰 변화(>10 mAU)를 만들려면 과산화수소 가 많거나 적은 것으로 샘플을 다시 만들고 섹션 3에 따라 샘플을 다시 실행합니다.
    2. ΔAbs265 판독값을 실시간으로 작은 변화시키기 위해 50mm 전동 스테이지를 사용하여 초점 렌즈의 위치를 조정하여 입사 빔의 초점 평면을 조정합니다. 모세관의 위치에 초점 평면을 가까이 가져 옴그랩265 판독을 증가시킬 것이다; 모세관의 위치에서 초점 평면을 더 멀리 가져옴그랩265 판독값이 감소합니다.
  3. 아데닌ΔAbs(265)를 모니터링하여 레이저 조사 후 시료에 존재하는 하이드록실 라디칼의 유효량을측정한다(13). 인라인 UV 모세관 검출기를 가진 실시간 모니터링은 4.2.2에 기술된 바와 같이 실시간 보상을 허용합니다; ΔAbs265 판독값이 원하는 판독값과 같을 때까지 전동 스테이지를 사용하여 렌즈 위치를 조정합니다. UV 분광계를 사용한 실험 후 흡광도 측정도 정확하지만, 효과적인 라디칼 용량마다 새로운 샘플을 사용해야 합니다.

5. 단백질 샘플을 소화

참고: 트립신은 FPOP를 위한 단백질 견본을 소화하기 위하여 가장 일반적으로 이용되고, 이 프로토콜에 사용된 protease입니다. 그것은 N-및 C-종자 모두에서 기본 사이트와 펩 티 드를 생성 하는 신뢰할 수 있는 protease, MS에서 곱 하 고 펩 티 드 이온을 촉진. 더욱이, 리신과 아르기닌 후 갈라지며, 하이드록실 라디칼에 적당히 반응하는 두 가지 아미노산; 따라서, 문분해 산화로 인한 소화 패턴의 변화는 드물다. 다른 프로테아제는 FPOP21과함께 성공적으로 사용되었지만 소화 패턴이 산화되지 않은 샘플과 산화 된 샘플 과 비교할 수 있도록주의해야합니다.

  1. 담금질한 FPOP 샘플의 최종 볼륨을 측정합니다. 500mM Tris, pH 8.0, 10mM CaCl 2를 함유한 10mM CaCl2를 50mM Dithiothreitol(DTT)을 함유하고 있으며, 최종 농도는 50mM Tris, 1mM CaCl2 및 5mM DTT로 담금질한 후 단백질 용액에 추가합니다.
  2. 단백질 샘플을 95°C에서 15분간 가열합니다.
  3. 즉시 2 분 동안 얼음에 샘플을 냉각.
  4. 샘플에 1:20 트립신/단백질 체중 비율을 추가합니다.
  5. 단백질을 37°C에서 혼합하여 밤새 소화합니다.
  6. 0.1%의 포믹산을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 샘플을 95°C로 10분 동안 가열한다.
  7. 2mM DTT를 샘플에 추가하고 LC-MS/MS 직전 15분 동안 60°C에서 가열합니다.
    참고: 다른 그룹은 FPOP 실험에서 티올의 알킬레이션을 보고했지만, 우리의 손에는 산화 된 단백질의 알킬레이션시 측면 제품을 지적했습니다 (아마도 사소한 산화 제품으로 형성 된 뉴클레오필화 탄산염과의 반응으로 인해). 따라서 가능하면 티올의 알킬을 피하기로 결정합니다.

6. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 수행(LC-MS/MS)

  1. 0.1%의 포믹산과 이동상 B를 함유한 물로 구성된 이동상 A를 0.1%의 포믹산으로 준비한다.
  2. 샘플을 C18 트랩 컬럼(300 μm I.D. x 5mm 100 Å 모공 크기, 5 μm 입자 크기)에 먼저 적재하고 5.0 μL/min의 유속으로 3분간 용매 B로 세척하여 염과 친수성 소분자를 제거합니다.
  3. 그런 다음 300 nL/min의 유속도로 C18 나노컬럼(0.75mm x 150mm, 2 μm 입자 크기, 100 Å 모공 크기)에 펩티드를 분리합니다. 그라데이션은 22분 이상 2~35% 용매 B에서 35%로 선형 증가하여 5분 이상 용매 B로 진입한 후 3분 동안 유지되어 3분 동안 2%B로 돌아와 3분 동안 2%B로 돌아와 컬럼을 다시 보정합니다.
    참고: 이 그라데이션은 대부분의 1-2 단백질 FPOP 혼합물의 LC-MS/MS에 충분하여 펩티드 수준의 정량화를 하고자 합니다. 용매 B의 백분율은 펩티드가 유사한 보존 시간 및 m/z 값으로 인해 서로 간섭하는 드문 경우의 펩티드 해상도를 높이기 위해 변경되어야 할 수 있습니다. 프로테오메 스케일FPOP(22) 또는 펩타이드 산화 제품 이소머스1,,23,24,,25를 분리하고자 하는 실험 설계는 더 긴 LC 그라데이션이 필요할 수 있으며 본 보고서의 범위를 벗어난다.,
  4. 전도성 나노 스프레이 방출기를 사용하여 고해상도 질량 분광계의 나노 스프레이 소스로 펩티드를 직접 엘테합니다.
  5. 양수 이온 모드에서 데이터를 획득합니다. 스프레이 전압을 2400 V로 설정하고 이온 이송 튜브의 온도를 300°C로 설정합니다.
  6. m/z 250에서 2000년까지 m/z 2000에서 60,000의 명목 해상도로 전체 MS 스캔을 획득한 다음, 35%의 정규화된 에너지로 충돌 유도 해리를 사용하여 가장 풍부한 8개 펩타이드 이온에 8개의 후속 데이터 의존선형 이온 트랩 MS/MS 스캔을 실시한다. 펩티드를 30s 내에서 최대 5회 까지 단편화한 다음 60s에 대한 배제 목록으로 옮김합니다.

7. 펩티드의 평균 산화의 데이터 처리 및 계산

  1. MS/MS 프로테오믹스 검색 엔진을 사용하여 단백질, m/z 값 및 산화되지 않은 펩타이드의 서열 커버리지를 결정한다.
  2. 전구체 질량 내성을 10 ppm으로 설정하고 표준 트립신 분열 특이성을 사용하여 트립신 소화 시료에 대해 최대 2개의 누락된 골짜기 부위를 허용합니다.
  3. 펩티드 질량 단편 질량 내성을 0.4 달톤으로 설정합니다.
  4. 주요 산화 제품의 수정되지 않은 펩타이드 및 공지된 질량 이동의 m/z 비율에 기초하여, 각 펩티드4,,26,,27,,28,29의다양한 이론산화 제품의 m/z를 계산한다.,
  5. 대량 분광 실행을 보려면 소프트웨어를 사용하여 이러한 m/z 값의 추출된 이온 크로마토그램을 식별합니다(그림4). 그들의 m/z,그들의 전하 상태 및 수정되지 않은 펩티드에 용출 시간의 유사성에 기초하여 펩티드 산화 제품을 식별합니다. 우리의 손에, 펩티드 산화 제품은 위의 LC 그라데이션을 사용하여 수정되지 않은 펩타이드 후 240 초 에서 180 초 사이에 elute. 산화는 종종 여러 이소성 산화 제품을 초래할 수 있으므로, 도 4에도시된 바와 같이 펩타이드 산화 제품의 추출된 이온 크로마토그램에서 여러 부분 적으로 해결된 피크를 관찰하는 것이 일반적이다. 펩티드 산화 제품은 추출된 이온 크로마토그램에서 피크의 면적에 따라 정량화된다.

figure-protocol-2
그림 4: 펩타이드의 이온 크로마토그램추출및 그 산화 제품은 FPOP 후. 펩티드 산화 제품의 m/z는 산화되지 않은 펩타이드 및 공지된 산화 제품의 m/z에 기초하여 계산됩니다. 이러한 펩티드 제품의 영역이 결정된다. 펩티드 제품의 영역은 펩티드당 평균 산화 이벤트의 계산에 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 다음 방정식을 사용하여 펩타이드의 평균 산화를 계산합니다.

figure-protocol-3

여기서 P는 펩티드 분자당 평균 산화 이벤트 수를 나타내고, 나는 산화되지 않은 펩티드(Iunoxidized)와 n 산화 이벤트를 가진 펩티드의 피크 영역을 나타낸다.Iunoxidized I(singly 산화)에는 단일 산소 원자의 추가뿐만 아니라 조사관이 측정할 수 있는 덜 일반적인 단일 산화 이벤트(예: 산화 탈카르복틸레이션, 카보닐 형성 등)도 포함됩니다. 4,,26,,27,,28,,29.

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결과

인산염 완충제에서 아달리무맙 바이오시밀러의 중사슬 펩티드 발자국을 비교하고 55°C에서 1h로 가열하면 흥미로운 결과를 나타낸다. 학생의 t-테스트는 이 두 가지 조건에서 크게 변경되는 펩티드의 식별에 사용됩니다 (p ≤ 0.05). 펩타이드 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 및 414-420은 단백질이 골재를 형성하도록 가열될 때 용매로부터 상당한 보호를나타낸다(도 5)30. 이 실험은 가열 및 집계시 지형 변화를 경험하는 펩티드 영역을 확인했습니다.

figure-results-1
그림 5: 아달리무맙의 무거운 사슬의 펩티드 레벨 발자국...

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토론

수소-중수소 교환, 화학 교차 연결, 공유 라벨링, 네이티브 스프레이 질량 분석 및 이온 이동성을 포함한 질량 분광계 기반 구조 기술은 유연성, 감도 및 복잡한 혼합물을 처리하는 능력으로 인해 빠르게 인기를 얻고 있습니다. FPOP는 질량 분석 기반 구조 기술 분야에서 인기를 강화한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 대부분의 공유 라벨링 전략과 마찬가지로, 대부분의 포스트 라벨링 공정(예: 트립신 소화, 디글리코실레이션 등)과 호환되는 단백질 지형의 안정적인 화학 적 스냅샷을 제공하므로 수소 유두류 교환을 방해하는 백 교환 및 스크램블링 문제를 방지합니다. 그러나, 특정 아미노산을 대상으로 하는 전통적인 공유 라벨링 기술과는 달리, FPOP는 단일 실험에서 아미노산의 광범위 한 배열을 라벨수 있습니다. 더욱이, FPOP는 단백질보다 더 빠른 1차 하이드록실 라디칼 단백질 반응을 완료하여 네이티브형태(14)의화학적 스냅샷을 동결할 수 있지만, 일부 이차 반응은 느린 시간척도

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공개 사항

조슈아 S. 샤프는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국을 포함한 단백질 고주 구조 분석을 위한 기술을 상용화하고자 하는 소규모 회사인 GenNext Technologies, Inc.에 상당한 재정적 관심을 공개합니다.

감사의 글

우리는 고에너지 FPOP에 대한 표준화 및 dosimetry 프로토콜의 개발을위한 벤치 탑 FPOP 장치 및 R01GM127267의 상업적 개발을 지원하는 일반 의학 연구소의 연구 자금을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데닌아크로스 유기물147440250최대 3.5 mM의 물에 용해
Edmund Optics39-9051000 μ m 조리개 직경, 금도금 구리 조리개
조리개 홀더Edmund Optics53-28725.8mm 외경, 정밀 핀홀 마운트
CatalseSigma AldrichC-40Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥ 10,000 units/mg 단백질
COMPex Pro 레이저Coherent1113836COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF 레이저, No XeCl
Dithiotheitol (DTT)PromegaV3151DTT, 분자 등급(DL-Dithiothreitol)
분획 분취기GenNext Technologies, Inc.N/A자동 분획 수집기
용융 실리카 capillayMolex1068150023Polymicro Flexible 용융 실리카 모세관 튜브, 내경 100 & 마이크로; m, 외경 375 & 마이크로; m, TSP100375
글루타민아크로스 유기물119951000L(+)-글루타민, 99%
렌즈 홀더Edmund Optics03-66853mm 외경, 3나사 조절 가능한 링 마운트
과산화수소Fisher ScientificH325-100과산화수소, 30%(ACS 인증), Fisher Chemical
LC-MS/MS 시스템Thermo ScientificIQLAAEGAAPfadbmbcxOrbitap Fusion Tribrid 질량 분석기에 결합된 Dionex Ultimate 3000
Mas 사양 등급 AcetonitrileFisher ScientificA955-1Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
질량 분석기 등급 포름산Fisher ScientificA117-50Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS 등급, 피셔 케미컬
질량 분석 등급 물피셔 사이언티픽W6-4물, 옵티마 LC/MS 등급, 피셔 케미컬
MES 버퍼시그마 알드리치M0164MES 헤미소듐 염
메티오닌 아미드Bachem4000594.0005H-met-NH2. HCl
Micro V 클램프Thor LabsVK250Micro V-클램프, 스테인리스 스틸 블레이드
포함 전동 스테이지Edmund Optics68-63850mm 이동식 전동 스테이지 시스템, 수동 제어
Nano C18 컬럼Thermo Scientific164534Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼
광학 벤치Edmund Optics56-93518" x 18" 브레드보드
FPOP 모듈 시스템의 선구자GenNext Technologies, Inc.N/A인라인 FPOP 라디칼 선량 측정 시스템
포스트 홀더Edmund Optics58-9793" 길이, ¼-20 스레드, 포스트 홀더
인산나트륨 이염기성Fisher ScientificBP331-500인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 (무색-백색 결정), Fisher BioReagents
인산나트륨 단일염기성Fisher ScientificBP330-500인산나트륨 일염기성 일수화물(무색에서 백색 결정), Fisher BioReagents
주사기Hamilton81065100 µ L, 모델 1710 RN SYR, 소형 탈착식 NDL, 22s ga, 2 in, 포인트 스타일 3
주사기 펌프KD Scientific788101 Legato  101 주사기 펌프
트랩 C18 컬럼Thermo Scientific160454Thermo Scientific  Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼
TrisSigma Aldrich252859Tris(hydroxymethyl)aminomethane
TrypsinPromegaV5111시퀀싱 등급 수정 트립신
UV plano 볼록 렌즈Edmund Optics84-28530 mm Dia. x 120 mm FL 비코팅, UV Plano-Convex Lens
조리개

참고문헌

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