방법 논문

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

DOI:

10.3791/61594

⸱

2020년 9월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

이 논문에서

요약

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여기에서 우리는 DNA와 자살 플라스미드를 자연적으로 획득하는 능력을 사용하여 유전자 변형될 수 있는 S. pneumoniae 혈청형 1 균주 519/43에 대해 설명합니다. 원리의 증거로서, pneumolysin (ply) 유전자의 동종 돌연변이가 만들어졌다.

초록

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Streptococcus pneumoniae 혈청형 1은 저소득 및 중간 소득 국가, 특히 사하라 사막 이남 아프리카에서 여전히 큰 문제로 남아 있습니다. 그 중요성에도 불구하고, 이 혈청형에 대한 연구는 그것을 변형시키는 유전적 도구의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 이 연구에서 우리는 혈청형 1 임상 분리주(균주 519/43)를 유전적으로 변형시키는 방법을 설명합니다. 흥미롭게도 이것은 자연적으로 DNA를 획득하는 폐렴 구균의 능력을 이용하여 달성되었습니다. 그러나 대부분의 폐렴 구균과 달리 선형 DNA의 사용은 성공적이지 못했습니다. 이 중요한 균주를 돌연변이시키기 위해서는 자살 플라스미드를 사용해야 했습니다. 이 방법론은 생물학과 병원성 측면에서 이 파악하기 어려운 혈청형을 더 깊이 이해할 수 있는 수단을 제공했습니다. 이 방법을 검증하기 위해 알려진 주요 폐렴구균 독소인 뉴몰리신은 잘 알려져 있고 따르기 쉬운 표현형을 가지고 있기 때문에 돌연변이되었습니다. 우리는 예상대로 돌연변이가 적혈구를 용해시키는 능력을 상실했음을 보여주었습니다. 관심 혈청형에서 중요한 유전자를 돌연변이시킬 수 있게 됨으로써, 우리는 복강내 및 비강내 감염 시 기능 상실 돌연변이에 대해 다른 혈청형에 대해 관찰된 표현형과 다른 표현형을 관찰할 수 있었습니다. 요약하면, 이 연구는 균주 519/43(혈청형 1)이 유전자 변형될 수 있음을 증명합니다.

서론

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폐렴 연쇄상 구균 (S. pneumoniae, 폐렴 구균)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 최근까지 100개에 가까운 S. pneumoniae의 혈청형이 발견되었다 1,2,3,4,5,6,7. 매년 침습성 폐렴구균성 질환(IPD)으로 인해 약 700,000명이 사망하고 5세 미만 어린이가사망한다 8. S. pneumoniae는 전 세계적으로 세균성 폐렴, 중이염, 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다9.

아프리카 수막염 벨트에서 혈청형 1은 수막염 발병의 원인이 되며, 여기서 매우 독성이 강한 서열형인 서열형(ST) ST217이 우세합니다 10,11,12,13,....

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프로토콜

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1. SOE-PCR23 에 의한 돌연변이 앰플리콘의 생성 및 스펙티노마이신 카세트의 증폭

  1. 균주 519/43에서 플라이 유전자의 측면 영역의 상동성 팔(각각 ply 5'(488bp) 및 ply3'(715bp))의 증폭을 위해 PCR을 수행하는 것으로 시작합니다. 프라이머 plyFw1_NOTI(TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI(CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI(TCAAGGTCAAGTTTGGTTCT GGATCCCCTTTGGTCTATATTTCG) 및 plyRv2_NotI(TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC)를 사용합니다.
  2. ply5'에 대해 다음 PCR 조건을 사용하십시오: 94°C에서 60초 동안 변성, 2단계: 94°C에서 30초 동안 변성, 3단계: 58°C에서 30초 동안 어닐링, 4단계: 72°C에서 30초 동안 연장, 5단계: 2단계로 돌아가서 35주기 동안 반복, 6단계: 72°C에서 30초 동안 최종 확장.
    1. 3초여야 하는 4단계와 6단계의 연장 시간을 제외하고 ply60'에 대....

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결과

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여기에 설명된 프로토콜은 PCR을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암을 증폭하는 동시에 플라이 유전자의 중간 영역에서 191bp를 삭제하는 것으로 시작합니다. PCR을 수행하는 동안 BamHI 부위는 왼쪽 상동성 암의 3'와 오른쪽 상동성 암의 5' 말단에 도입됩니다(그림 1A). 그 다음에는 왼쪽 및 오른쪽 상동성 암이 하나의 앰플리콘으로 융합되는 PCR-SOE가 이어집니다(그림 1B). 그런 다음 이 SOE-PCR 앰플리콘을 TA 클로닝을 사용하여 pGEMTeasy에 클로닝하여 플라스미드 pSD1을 생성합니다(그림 1C). 성공적인 형질전환은 암피실린에 내성이 있는 백색 집락을 생성할 것입니다. 임의의 청색 콜로니는 빈 pGEMTeasy 플라스미드를 함유하는 형질전환체일 것이다. 그런 다음 pSD1은 SOE-PCR 시 도입된 BamHI 부위에서 소화.......

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토론

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폐렴 연쇄상 구균, 특히 혈청형 1은 침습성 폐렴구균 질환 및 수막염을 유발하는 세계적인 위협이 되고 있습니다. 혈청형 1을 예방해야 하는 다양한 백신이 도입되었음에도 불구하고, 아프리카에서는 이 혈청형이 여전히 높은 이환율과 사망률을 초래하는 발병을 일으킬 수 있다13. 이 혈청형을 유전적으로 조작하는 능력은 임상적 관련성 때문에 매우 중요합니다. 이 연구에 설명된 방법은 이 혈청형 내에서 대표적인 균주의 유전자 조작을 허용합니다. 침습성 균주 519/43(ST5316), 덴마크의 수막염 환자로부터 임상적으로 분리된 균주25.

여기에 제시된 방법론은 대부분 외인성 DNA를 획득할 수 있기 때문에 선택된 균주로 인해 성공적이었지만 S. pneumoniae 형질전환에 사용되는 기존 프로토콜의 변경으로 인해 당사의 형질전환 프로토콜에 대한 일반적인 성공률은 약 70%.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업에 자금을 제공 한 수막염 신탁과 MRC에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccuPrime Pfx DNA polymeraseInvitrogen12344024암
피실린 나트륨 염Sigma AldrichA95181 단계에서 박테리아 선택에 사용 (pSD1)
Blood Agar BaseOxoidCM0055S. pneumoniae< / em> 형질전환 물질
소 혈청 알부민시그마S. 폐렴 변환에 사용되는55470
뇌 심장 주입OxoidCM1135S. 폐렴 세포
Calcium Chloride Cacl2Sigma449709S. 폐렴 변환
역량 자극 펩타이드 1AnaSpecAS-63779S. pneumoniae Transformation
Luria BrothAgar Gibco22700025pSD1 및 pSD2
Luria Broth Base(Miller's formulation)Gibco12795027pSD1 및 pSD2 Monarch
Gel Extraction KitNEBT1020S에서 밴드를 추출하는 데 사용
Miniprep KitNEBT1010S세포에서 플라스미드를 추출하는 데 사용
pGEM T-easyPromegaA1360자살 플라스미드
S.O.C.Invitrogen15544034형질전환 후 세포 회수에 사용
수산화나트륨(NaOH)SigmaS0899S.pneumoniae 형질전환
스펙티노마이신 염산염SigmaAldrichPHR1426박테리아 선택에 사용
Subcloning Efficiency DH5α Competent CellsInvitrogen18265017pSD1 및 pSD2 생성에 사용됩니다
의 도금 및 선택에 사용 DNA 겔 Monarch Plasmid로 사용.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactiv....

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재인쇄 및 허가

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Streptococcus pneumoniaeSerotype 1Genetic ModificationPlasmid ConstructionNatural TransformationSuicide PlasmidPneumolysin MutationHemolytic Activity AssayBlue White SelectionRestriction Digestion

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