방법 논문

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

DOI:

10.3791/61594

⸱

2020년 9월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 DNA와 자살 플라스미드를 자연적으로 획득하는 능력을 사용하여 유전자 변형될 수 있는 S. pneumoniae 혈청형 1 균주 519/43에 대해 설명합니다. 원리의 증거로서, pneumolysin (ply) 유전자의 동종 돌연변이가 만들어졌다.

초록

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Streptococcus pneumoniae 혈청형 1은 저소득 및 중간 소득 국가, 특히 사하라 사막 이남 아프리카에서 여전히 큰 문제로 남아 있습니다. 그 중요성에도 불구하고, 이 혈청형에 대한 연구는 그것을 변형시키는 유전적 도구의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 이 연구에서 우리는 혈청형 1 임상 분리주(균주 519/43)를 유전적으로 변형시키는 방법을 설명합니다. 흥미롭게도 이것은 자연적으로 DNA를 획득하는 폐렴 구균의 능력을 이용하여 달성되었습니다. 그러나 대부분의 폐렴 구균과 달리 선형 DNA의 사용은 성공적이지 못했습니다. 이 중요한 균주를 돌연변이시키기 위해서는 자살 플라스미드를 사용해야 했습니다. 이 방법론은 생물학과 병원성 측면에서 이 파악하기 어려운 혈청형을 더 깊이 이해할 수 있는 수단을 제공했습니다. 이 방법을 검증하기 위해 알려진 주요 폐렴구균 독소인 뉴몰리신은 잘 알려져 있고 따르기 쉬운 표현형을 가지고 있기 때문에 돌연변이되었습니다. 우리는 예상대로 돌연변이가 적혈구를 용해시키는 능력을 상실했음을 보여주었습니다. 관심 혈청형에서 중요한 유전자를 돌연변이시킬 수 있게 됨으로써, 우리는 복강내 및 비강내 감염 시 기능 상실 돌연변이에 대해 다른 혈청형에 대해 관찰된 표현형과 다른 표현형을 관찰할 수 있었습니다. 요약하면, 이 연구는 균주 519/43(혈청형 1)이 유전자 변형될 수 있음을 증명합니다.

서론

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폐렴 연쇄상 구균 (S. pneumoniae, 폐렴 구균)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 최근까지 100개에 가까운 S. pneumoniae의 혈청형이 발견되었다 1,2,3,4,5,6,7. 매년 침습성 폐렴구균성 질환(IPD)으로 인해 약 700,000명이 사망하고 5세 미만 어린이가사망한다 8. S. pneumoniae는 전 세계적으로 세균성 폐렴, 중이염, 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다9.

아프리카 수막염 벨트에서 혈청형 1은 수막염 발병의 원인이 되며, 여기서 매우 독성이 강한 서열형인 서열형(ST) ST217이 우세합니다 10,11,12,13,14,15. 수막염 병리학에서의 중요성은 아프리카 수막염 벨트의 Neisseria meningitidis의 중요성에 비유되었습니다16. 혈청형 1은 종종 IPD의 주요 원인입니다. 그러나 마차에서는 거의 발견되지 않습니다. 사실, 감비아에서는 이 혈청형이 모든 침습성 질환의 20%를 차지하지만 건강한 보균자의 0.5%에서만 발견되었습니다14,17,18,19. 유능한 폐렴구균에서의 유전자 교환 및 재조합은 일반적으로 침습성 질환보다는 보균에서 발생한다20. 또한, 혈청형 1은 폐렴구균 중에서 가장 짧은 보균률(단 9일) 중 하나인 것으로 나타났습니다. 그러므로, 이 혈청형은 다른 혈청형보다 훨씬 낮은 재조합률을 가질 수 있다고 제안되었다21.

혈청형 1 균주의 낮은 운반률의 이유와 사하라 사막 이남 아프리카의 침습성 질병에서의 중요성을 이해하기 위해서는 심층 연구가 필요합니다.

여기에서 우리는 특정 혈청형 1 균주, 519/43의 게놈 전체 돌연변이 유발을 허용하는 프로토콜을 보고합니다. 이 균주는 새로운 DNA를 쉽게 획득하여 게놈으로 재결합할 수 있습니다. 이 방법은 아직 변형되지 않았지만 519/43 배경에서 수행될 때 매우 효율적입니다(다른 표적은 돌연변이가 발생했으며 원고는 준비 중입니다). 단순히 519/43 균주를 사용하고 그 타고난 능력을 활용하고 외인성 DNA가 제공되는 방식을 대체함으로써 우리는 이 혈청형 1 균주에서 뉴몰리신 유전자(ply)를 돌연변이시킬 수 있었습니다. 이 방법은 Harvey et al.22 가 제시한 방법에 대한 개선을 나타내며, 다른 혈청형을 통해 DNA를 통과시킬 필요 없이 한 단계로 수행됩니다. 그럼에도 불구하고, 균주 간 가변성으로 인해, 모든 균주에 대해 표준화된 방법은 없다. 특정 유전자를 돌연변이시키고 그 효과를 관찰하는 능력은 혈청형 1 S. pneumoniae 균주에 대한 심오한 이해를 가능하게 할 것이며 사하라 사막 이남 아프리카의 수막염에서 이러한 균주의 역할에 대한 답을 제공할 것입니다.

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프로토콜

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1. SOE-PCR23 에 의한 돌연변이 앰플리콘의 생성 및 스펙티노마이신 카세트의 증폭

  1. 균주 519/43에서 플라이 유전자의 측면 영역의 상동성 팔(각각 ply 5'(488bp) 및 ply3'(715bp))의 증폭을 위해 PCR을 수행하는 것으로 시작합니다. 프라이머 plyFw1_NOTI(TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI(CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI(TCAAGGTCAAGTTTGGTTCT GGATCCCCTTTGGTCTATATTTCG) 및 plyRv2_NotI(TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC)를 사용합니다.
  2. ply5'에 대해 다음 PCR 조건을 사용하십시오: 94°C에서 60초 동안 변성, 2단계: 94°C에서 30초 동안 변성, 3단계: 58°C에서 30초 동안 어닐링, 4단계: 72°C에서 30초 동안 연장, 5단계: 2단계로 돌아가서 35주기 동안 반복, 6단계: 72°C에서 30초 동안 최종 확장.
    1. 3초여야 하는 4단계와 6단계의 연장 시간을 제외하고 ply60'에 대해 동일한 PCR 조건을 사용합니다.
  3. 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석하고 겔에서 앰플리콘을 절제합니다.
  4. PCR 정제amp제조업체의 지침(재료 표)에 설명된 프로토콜에 따라 licons.
  5. SOE-PCR에서 두 상동성 암의 등몰량을 템플릿으로 사용합니다. 프라이머 plyFw1_ NOTI(TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) 및 plyRv2_NotI(TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC)를 사용하여 두 앰플리콘을 융합합니다.
  6. 다음 SOE-PCR 조건을 사용합니다(1단계: 94°C에서 2분 동안 변성, 2단계: 94°C에서 30초 동안 변성, 3단계: 58°C에서 30초 동안 어닐링, 4단계: 68°C에서 60초 동안 연장, 5단계: 2단계로 돌아가서 25주기 반복, 6단계: 68°C에서 90초 동안 최종 확장).
  7. 겔 전기영동으로 SOE-PCR 산물을 분석합니다. 젤 추출 키트를 사용하여 젤에서 절제하고 제공된 지침을 따르십시오.
  8. 다음 PCR 조건을 사용하여 플라스미드 pR412로부터 스펙티노마이신 카세트를 증폭한다: 단계 1: 94°C에서 60초 동안 변성, 단계 2: 94°C에서 30초 동안 변성, 단계 3: 55°C에서 30초 동안 어닐링, 단계 4: 68°C에서 60초 동안 연장, 5단계: 단계 2로 돌아가서 25사이클 동안 반복하고, 6단계: 68°C에서 60초 동안 최종 연장.
    1. 프라이머 BamHI_SP2F2(GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) 및 BamHI_SP2R2(GGATCC, AA, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC)를 사용합니다. 플라스미드 pR412는 Marc PrudHomme 박사(CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse France)로부터 입수하였다.
  9. 겔 전기영동으로 PCR 앰플리콘을 분석합니다. 생성된 PCR 앰플리콘을 상기와 같이 소비하고 정제한다.

2. 플라스미드 pSD1의 생성 및 대장균 Dh5α의 화학적 형질전환

  1. pGEMT-easy 시스템 I 제조업체 지침(재료 표)에 따라 결찰을 수행합니다. 미세 원심분리기 튜브에서 5μL의 2x 결찰 완충액, 1μL의 pGEMTeasy, 2μL의 ply_SOE 생성물, 1μL의 T4 DNA 리가제 및 물을 총 부피 20μL에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이것은 플라스미드 pSD1을 생성한다.
  2. 화학적으로 유능한 대장균 Dh5α를 pSD1로 변형시킵니다. 얼음에서 15분 동안 화학적으로 유능한 대장균 Dh5α 50μL와 pSD1 결찰 반응 3μL을 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 세포를 열 충격(42°C, 30초)에 노출시켜 계속합니다. 세포를 얼음 위에 2분 동안 두십시오.
  3. 얼음에서 세포를 제거하고 350 μL의 S.O.C 배지를 추가합니다. 배양액을 37°C, 120 rpm에서 2시간 동안 배양한다.
  4. 0.4mM IPTG, 청색/백색 선택을 위한 0.24mg/mL X-Gal 및 100μg/mL 암피실린이 보충된 Luria Bertani Agar(LBA)에서 형질전환을 플레이트하여 플레이트에서 성장하는 모든 콜로니가 플라스미드 골격을 갖도록 합니다. 백색 콜로니는 pSD1을 함유한다.
  5. 3개의 흰색 콜로니를 선택하고 100μg/mL 암피실린이 보충된 10mL의 LB에서 하룻밤 동안 성장하도록 설정합니다. 진탕과 함께 37°C에서 하룻밤 동안 배양물을 배양한다.
  6. 다음날 배양물을 3,082 x g 에서 원심분리하고 플라스미드 추출을 위해 펠릿을 사용합니다.

3. 플라스미드 DNA 추출, pSD1 및 스펙티노마이신 유전자의 제한 소화 및 pSD2 조립

  1. 상용 키트(Table of Materials)와 함께 제공된 지침에 따라 플라스미드 DNA를 추출합니다.
  2. pSD1 플라스미드와 이전에 증폭 및 정제된 스펙티노마이신 카세트 모두에 대해 BamHI 제한 분해를 설정합니다. 표 1에 설명된 다음 조건 및 수량을 사용하십시오.
  3. 제한 소화 반응 및 대조군을 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
  4. 전기영동에 의해 제한 소화를 분석하고, 밴드를 절제하고, 상용 키트와 함께 제공된 지침에 따라 정제합니다(재료 표).
  5. 다음에, BamHI-분해된 pSD1 및 스펙티노마이신(단계 3.2로부터)을 사용하여 제조사 지침(Table of Materials)에 따라 결찰 반응을 준비한다. 미세 원심분리 튜브에 다음 반응 성분을 첨가하십시오: 5 μL의 2x 결찰 완충액, 2 μL pSD1, 2 μL의 스펙티노마이신 카세트, 1 μL의 T4 DNA 리가아제를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 이것은 플라스미드 pSD2를 생성한다.
  6. 플라스미드 pSD2를 단계 2.2에 기재된 바와 같이 화학적으로 유능한 대장균 Dh5α로 형질전환시킨다.
  7. 100μg/mL의 스펙티노마이신 및 암피실린이 보충된 LBA에서 성장하는 능력에 따라 플라스미드 pSD2를 운반하는 형질전환체를 선택합니다.
  8. 플라스미드 DNA 추출(pSD2)을 상기와 같이 수행하고 제조업체의 지침(μL)에 따라 수행합니다.

4. S. pneumoniae 균주의 변형 519/43

  1. BHI에서 S. pneumoniae 519/43의 하룻밤 배양액을 준비하고 37°C, 5%CO2에서 정적으로 성장하도록 합니다.
  2. 다음날 배양물을 1:50 및 1:100의 신선한 BHI 브로스 10mL에 희석합니다. OD595nm 가 0.05 내지 0.1 사이가 될 때까지 37°C에서 정적으로 배양물을 배양한다(0.1 OD에 가까운 DNA의 최적 획득).
  3. OD가 0.1에 도달하면 860 μL를 취하여 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 동일한 미세 원심분리 튜브에 100μL의 100mM NaOH, 10μL의 20%(w/v) BSA, 10μL의 100mM CaCl2, 2μL의 50ng/mL CSP124 및 500ng의pSD2를 추가합니다.
  4. 반응을 37°C에서 3시간 동안 정적으로 배양합니다.
  5. 330 μL를 100 μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 5% 혈액 한천 플레이트(BA)에 3시간 동안 매시간 플레이트합니다.
  6. 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 밤새 인큐베이션한다. 스펙티노마이신 내성 콜로니를 100μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 다른 BA 플레이트와 100μg/mL의 암피실린이 보충된 BA 플레이트에 패치합니다. 위에 명시된 조건에서 두 세트의 플레이트를 하룻밤 동안 배양하십시오. 암피실린 플레이트는 플라스미드 골격의 존재를 시험하기 위한 것이다.
  7. 프라이머 plyFw1_ NOTI(TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) 및 SPEC_REV(TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG)를 사용하여 PCR로 스펙티노마이신 카세트의 존재를 확인합니다. 돌연변이 부위 외부에 부착되는 프라이머 plySCN1(CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA)과 plySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT)를 이용하여 PCR로 돌연변이를 확인한다.
  8. 프라이머 plySCN1(CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) 및 스펙티노마이신 카세트 sqr1(CCTGATCCAAACATGTAAGTACCACC), sqf2(CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1(GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) 및 spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG에 결합 부위가 있는 프라이머를 사용하여 시퀀싱하여 게놈의 올바른 위치에 통합을 확인합니다.

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결과

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여기에 설명된 프로토콜은 PCR을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암을 증폭하는 동시에 플라이 유전자의 중간 영역에서 191bp를 삭제하는 것으로 시작합니다. PCR을 수행하는 동안 BamHI 부위는 왼쪽 상동성 암의 3'와 오른쪽 상동성 암의 5' 말단에 도입됩니다(그림 1A). 그 다음에는 왼쪽 및 오른쪽 상동성 암이 하나의 앰플리콘으로 융합되는 PCR-SOE가 이어집니다(그림 1B). 그런 다음 이 SOE-PCR 앰플리콘을 TA 클로닝을 사용하여 pGEMTeasy에 클로닝하여 플라스미드 pSD1을 생성합니다(그림 1C). 성공적인 형질전환은 암피실린에 내성이 있는 백색 집락을 생성할 것입니다. 임의의 청색 콜로니는 빈 pGEMTeasy 플라스미드를 함유하는 형질전환체일 것이다. 그런 다음 pSD1은 SOE-PCR 시 도입된 BamHI 부위에서 소화...

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토론

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폐렴 연쇄상 구균, 특히 혈청형 1은 침습성 폐렴구균 질환 및 수막염을 유발하는 세계적인 위협이 되고 있습니다. 혈청형 1을 예방해야 하는 다양한 백신이 도입되었음에도 불구하고, 아프리카에서는 이 혈청형이 여전히 높은 이환율과 사망률을 초래하는 발병을 일으킬 수 있다13. 이 혈청형을 유전적으로 조작하는 능력은 임상적 관련성 때문에 매우 중요합니다. 이 연구에 설명된 방법은 이 혈청형 내에서 대표적인 균주의 유전자 조작을 허용합니다. 침습성 균주 519/43(ST5316), 덴마크의 수막염 환자로부터 임상적으로 분리된 균주25.

여기에 제시된 방법론은 대부분 외인성 DNA를 획득할 수 있기 때문에 선택된 균주로 인해 성공적이었지만 S. pneumoniae 형질전환에 사용되는 기존 프로토콜의 변경으로 인해 당사의 형질전환 프로토콜에 대한 일반적인 성공률은 약 70%...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업에 자금을 제공 한 수막염 신탁과 MRC에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccuPrime Pfx DNA polymeraseInvitrogen12344024암
피실린 나트륨 염Sigma AldrichA95181 단계에서 박테리아 선택에 사용 (pSD1)
Blood Agar BaseOxoidCM0055S. pneumoniae< / em> 형질전환 물질
소 혈청 알부민시그마S. 폐렴 변환에 사용되는55470
뇌 심장 주입OxoidCM1135S. 폐렴 세포
Calcium Chloride Cacl2Sigma449709S. 폐렴 변환
역량 자극 펩타이드 1AnaSpecAS-63779S. pneumoniae Transformation
Luria BrothAgar Gibco22700025pSD1 및 pSD2
Luria Broth Base(Miller's formulation)Gibco12795027pSD1 및 pSD2 Monarch
Gel Extraction KitNEBT1020S에서 밴드를 추출하는 데 사용
Miniprep KitNEBT1010S세포에서 플라스미드를 추출하는 데 사용
pGEM T-easyPromegaA1360자살 플라스미드
S.O.C.Invitrogen15544034형질전환 후 세포 회수에 사용
수산화나트륨(NaOH)SigmaS0899S.pneumoniae 형질전환
스펙티노마이신 염산염SigmaAldrichPHR1426박테리아 선택에 사용
Subcloning Efficiency DH5α Competent CellsInvitrogen18265017pSD1 및 pSD2 생성에 사용됩니다
의 도금 및 선택에 사용 DNA 겔 Monarch Plasmid로 사용.

참고문헌

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