단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

요약

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

초록

iPSC 유래 심근세포의 성숙은 재생 치료, 약물 검사 및 질병 모델링에 있는 그들의 신청에 대한 중요한 문제점입니다. 다중 분화 프로토콜의 발달에도 불구하고 성인과 같은 표현형을 닮은 iPSC 심근세포의 생성은 여전히 도전적입니다. 심근 세포 성숙의 한 가지 주요 측면은 높은 수축 용량을 보장하기 위해 잘 조직 된 sarcomere 네트워크의 형성을 포함한다. 여기에서는 심근세포에서 α 액티닌 네트워크의 반정량 분석을 위한 슈퍼 분해능 기반 접근 방식을 제시합니다. 광활성화 국소화 현미경을 사용하여 신생아 조직으로부터 분리된 iPSC 유래 심근세포 및 심장 세포의 사코프레 길이 및 z-디스크 두께의 비교가 수행되었다. 동시에 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 이미징 조건의 중요성을 입증합니다. 우리의 결과는 이 방법이 높은 공간 해상도로 심장 세포의 구조적 성숙도를 정량적으로 모니터링하는 데 적합하다는 것을 보여 주어 sarcomere 조직의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

서론

심근 경색 또는 심근병증과 같은 심혈관 질환(CVD)은 서구 세계^1에서주요 사망 원인으로 남아 있다. 인간의 심장은 가난한 재생 능력을 가지고 있기 때문에, CVD에서 회복을 촉진하기위한 전략에 대한 필요가있다. 여기에는 분실된 심근세포(CM)를 보충하기 위한 세포 대체 요법뿐만 아니라 효율적이고 안전한 제약 개입을 위한 새로운 부정맥 약물의 개발이 포함됩니다. 유도만능 줄기세포(iPSC)는 생체외에서 인간 CM의 무제한 생성을 위한 유망한 세포공급원으로 나타났으며, 재생 요법, 질병 모델링, 약물 스크리닝 어세서^2,,3,,4의개발에 적합하게 된다.

많은 다른 심장 분화 프로토콜이 존재하지만, iPSC 유래 CM은 여전히 시험관 내 및 생체 내 응용 프로그램^5,,6을방해하는 특정 표현성 및 기능적 측면이 부족하다. 전기 생리학, 대사 및 분자 변화 외에도 심장 성숙 과정은 힘 생성 및 세포^수축7에필요한 기본 단위인 sarcomeres의 구조 적 조직을 포함한다. 성인 CM은 잘 조직된 수축 장치를 전시하는 동안, iPSC 유래 CM은 일반적으로 수축 능력 감소 및 변경된 수축 역학과 관련된 분리된 사코레 필라멘트를 입증한다^8,,9. 단축 수축 패턴을 보이는 성숙한 CM과는 달리, 미숙한 CM의 방향감각 구조는 전체 세포의 방사형 수축을 초래하거나 수축 초점점^9,,10의출현을 촉진한다.

심장 성숙을 개선하기 위해 3D 세포 배양 방법, 전기 및 기계적 자극뿐만 아니라 생체 조건에서 모방된 세포외 행렬의^{사용(11,,12,13)을}포함한 여러^접근법이적용되었다. 이러한 다양한 배양 조건의 성공과 효율성을 평가하기 위해서는 미세한 기술로 iPSC CM의 구조적 성숙 정도를 모니터링하고 추정하기 위한 기술이 필요합니다. 기존의 공초점 영상과는 달리, 광활성화 국소화 현미경검사(PALM)의 경우 해상도는 약 10배 더 높다. 이 기술은 차례로 세포 구조물의 미묘한 변경을 검출하는 더 정확한 분석을 가능하게^{합니다(14)}. PALM 기반 이미징의 고해상도를 고려할 때, 이 방법의 전반적인 목표는 z-Disc 두께 및 사코메 길이의 정확한 측정에 의한 iPSC 유래 CM에서 sarcomere 성숙도의 현미경 평가였습니다. 이전 연구에서, 이러한 구조적 특징은 심장 성숙도를 평가하기 에 적합한 매개 변수로 표시되었습니다^(15. 예를 들어, 병에 걸린 iPSC-CM전체 길이 디스트로핀이 부족한 경우 야생형^{세포(16)와}비교했을 때 사코름 길이및 z대역 폭이 감소한다. 마찬가지로, 개별 사파레의 길이는 심장 발달에 지형 단서의 충격을 조사하기 위하여 측정되었다^16. 따라서, 우리는 정량적으로 sarcomere 길이와 z 디스크 두께를 측정하여 iPSC-CM에서 sarcomere 네트워크의 구조적 성숙을 평가하기 위해이 접근 방식을 적용했다.

프로토콜

신생아와 성인 마우스를 관련시키는 이 프로토콜에 있는 모든 단계는 로스톡 대학 의료 센터의 동물 배려를 위한 윤리적인 지침에 따라 수행되었습니다.

1. iPSC 유래 심근세포의 재배 및 해리

1. ^이전에설명된 바와 같이 2D 단층 방법을 사용하여 25일 동안 hiPSC-CM을 차별화한다.
2. 37°C에 미리 떼어내며 중온에서 실온을 지원합니다.
3. PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.
4. 세포에 미리 예온된 해리 배지를 추가하고 37°C및 5% CO_2에서12분 동안 배양한다.
5. 셀에 지지 매체를 추가합니다.
   참고: 추가된 지지 매체의 부피는 1.4단계에서 사용되는 해리 매체의 두 배여야 합니다.
6. 5mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 세포를 빼내게 한다.
7. 원심분리기 세포는 200 x g에서 5분 동안 및 hiPSC-CM 배양 배지^17의3mL에서 펠릿을 재연한다.
8. 종자 세포 8 잘 유리 바닥 챔버의 세포 밀도에서 75,000 세포 /잘 및 배양 3 일 동안.

2. 성인 심근세포 격리

1. NMRI 마우스로부터 의 성인 심근세포의 격리 및 재배는 이전에 보고된 바와 같이^{수행되었다 18.}
2. 종자 세포 8 잘 유리 챔버 슬라이드 및 문화에서 하루 동안.

3. 신생아 심근세포의 격리 및 재배

1. NMRI 마우스로부터 수득된 신생아 심근세포의 격리 절차는 이전에 설명된 바와 같이^{수행되었다 19.}
2. 종자 분리세포는 신생아 CM 배양배지에서 3일간 75,000세포/웰 및 배양의 세포 밀도로 8개의 유리 챔버^{슬라이드를}한다.

4. α 액티닌 네트워크의 면역 형광 라벨

참고: 최적의 결과를 위해, 세포는 8 잘 유리 바닥 챔버에서 배양된다. 라벨링은 이미징 을 하기 하루 전에 수행해야 합니다.

1. 37 °C에서 사전 웜 4 % PFA.
2. 배양 매체에 직접 4% 파라포름알데히드를 추가하여 iPSC-CM을 수정(1:1 희석) 15분 동안 37°C에서 배양한다. 고정을 위한 PFA의 최종 농도는 2%입니다.
3. PBS에서 희석된 0.2% 트리톤-X에서 고정 셀을 실내 온도에서 5분 동안 배양합니다.
4. PBS로 두 번, 각각 5 분 세척.
5. 1% BSA 용액(PBS에서 희석)을 추가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
6. 0.05% Triton-X를 함유한 1%BSA에서 α 액틴 항체 1:100을 희석하여 1차 항체 용액의 150 μL을 준비한다. 셀에 추가하고 60 분 동안 실온에서 배양하십시오.
7. 0.2% BSA 용액으로 두 번 세척할 수 있으며, 각각 5분.
8. 염소 항마우스 Alexa647 항체를 1%BSA에서 1:100으로 희석하여 이차 항체 용액의 150 μL을 준비하여 0.05% Triton-X를 함유한다. 셀에 추가하고 40 분 동안 실온에서 배양하십시오.
9. 0.2% BSA 용액으로 두 번 세척할 수 있으며, 각각 5분.
10. PBS로 두 번, 각각 5 분 세척. PALM 이미징이 될 때까지 4°C에서 어두운 상태로 표지된 세포를 유지합니다.

5. PALM 이미징 버퍼 의 준비

참고: 각 실험에 대해 PALM 이미징 버퍼를 신선하게 준비하는 것이 중요합니다.

1. 증류수 50mL에 25g의 포도당을 용해하여 50% 포도당 용액을 준비하십시오.
2. 50m Tris-HCl, 10% 포도당 및 10mM 염화나트륨을 함유한 기본 버퍼를 준비하십시오.
   1. 염산을 사용하여 pH 레벨을 ~8.0으로 조정합니다.
3. 기본 완충제의 316 μL에서 0.6 mg 의 피라노스 산화를 용해하여 피라노스 산화제 용액을 준비하십시오.
4. 기본 버퍼 500 μL에 7 mg의 카탈라아제를 용해하여 카탈라제 용액을 준비하십시오. 10,000 x g에서 3분 간 철저하게 혼합하고 원심분리기를 섞습니다. 추가 사용을 위해 상체를 유지합니다. 카탈라제 용액은 며칠 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다.
5. 316 μL의 피라노스 산화용액, 카탈라제 용액 25μL, 50% 포도당 용액의 100 μL, 시스팀진 50μL, 사이클로오텐 5μL, β 메카포에탄솔 3.5 μL을 혼합하여 PALM 이미징 버퍼 500 μL을 준비하십시오. 피라노스 산화제와 카탈라제의 최종 촉매 활성은 각각 7.5 U, 35,00U가 되어야 합니다.
   참고: PALM 이미징 버퍼는 3-5h에 최적의 이미징 조건을 제공합니다. 형광염의 깜박임 기능이 감소하면 새 버퍼 알리쿼트를 준비하십시오.

6. 팜 이미지 수집

1. 사용 전에 현미경을 최소 3시간 켜고 열 평형을 허용하기 위해 이미징 전에 샘플을 실온으로 가져옵니다. 현미경이 인큐베이션 챔버를 장착한 경우 온도를 30°C로 조정합니다.
2. 적절한 세척 용매를 사용하여 챔버 슬라이드의 목표와 바닥을 청소하십시오.
3. 300 μL의 PALM 이미징 버퍼를 라벨이 부착된 셀의 한 웰에 넣고 챔버 슬라이드를 현미경의 스테이지 홀더에 삽입합니다.
4. PALM 이미지 수집 매개 변수를 설정합니다.
   1. 인수시 1.57 N.A. 100배 의 석유 목표를 선택합니다.
   2. PALM 모드를 선택하고 TIRF 설정을 활성화합니다.
   3. 획득할 프레임 수를 조정합니다. 일반적으로 5, 000-10, 000 프레임은 최적의 결과를 얻기에 충분합니다. 그러나, 획득된 프레임의 수는 형광염의 라벨링 효율 및 깜박임 능력에 따라 크게 좌우되며 사용자가 조정할 수 있다.
   4. UV 레이저 전력을 0.1% 및 647 레이저로 0.2%로 설정합니다.
   5. 게인 레벨을 50-100으로 설정합니다.
   6. 레이저 조명을 켜고 대상 셀을 선택합니다. 신호 강도가 낮으면 게인 수준을 높일 수 있습니다(형광 라벨링에 따라 다름).
   7. 레이저 조명 끄기
5. 팜 이미지 수집
   1. 게인을 0으로 줄이고 레이저 전력(ex 647)을 100%로 늘립니다.
   2. ~5s에 대한 대상 셀을 표백합니다.
   3. 이득을 50으로 늘리고 PALM 이미지 수집을 시작합니다.
      참고: 과포화 픽셀을 피해야 하는 동안 충분한 신호 강도를 얻으려면 게인을 조정해야 합니다. 신호 강도가 감소하면 게인 레벨을 늘립니다.
6. 선택적으로, 꾸준히 UV 레이저 전력을 향상 (0.1%-10%) 신호 강도를 높이고 불소조의 깜박임을 촉진합니다.

7. 팜 데이터 재구성

1. 이미지 J 소프트웨어를 열고 PALM 데이터를 가져옵니다.
2. 오픈 뇌우 플러그인 및"실행 분석"
   1. "카메라설정"메뉴에서픽셀 크기와 EM 게인을 입력합니다.
      참고: 100x 목표와 1.6배배율 렌즈를 사용하는 경우 100nm 픽셀 크기가 적절합니다. 그러나 픽셀 크기는 PALM 이미징에 사용되는 현미경 및 카메라의 하드웨어 기능에 따라 달라지므로 사용자는 이 매개 변수를 주의 깊게 확인하고 조정해야 합니다. EM 게인 값은 메타데이터에서 얻을 수 있습니다.
   2. "실행분석 메뉴"와같이 매개 변수를 설정 : B-스플래라인 순서 : 3, B-스플래라인 배율 : 2.0, 피크 강도 임계 값 : stf (Wave.F1), 피팅 반경 : 3, 초기 시그마 : 1.6, 배율 : 5.0, 업데이트 주파수 : 50, 측면 교대 : 2. 확인 "확인"
3. 재구성된 PALM 이미지의 사후 처리
   1. "플롯히스토그램"메뉴에서"시그마"매개 변수를 선택합니다.
   2. "사각형"도구를 사용하여 가능한 아티팩트를 제외한 ROI를 선택하고 필터에 ROI를 적용합니다. ROI 값은 필터 명령 상자에 나타납니다.
   3. ROI값에 "&불확실성 &25"를추가합니다. 가능한 필터 명령은 다음과 같습니다 : "(시그마 & 48.6821 & 시그마 & 1117.40) & 불확실성 & lt;25". 선택한 시그마 값을 적용합니다.
   4. "중복제거" 메뉴, "10 nm"의 거리 임계 값을 입력하고 적용합니다.
   5. "병합메뉴"에서최대 거리를 "20"로 설정하고 분자당 최대 프레임을 "0"으로 설정하고 최대 오프 프레임에서 "1"로 설정합니다. 설정을 적용합니다.
   6. "드리프트 보정 메뉴"에서교차 상관 관계를 선택하고 "5"와"배율"에서"5.0"으로"쓰레기통 수"를설정합니다. 드리프트 보정 설정을 적용합니다.
   7. 원하는 경우 최종 PALM 이미지를 저장하고 사후 처리 된 데이터를 내보냅니다.

8. 사마레 필라멘트의 분석

1. 사컴레 길이 분석
   1. 이미지 J 소프트웨어를 열고 재구성된 PALM 이미지를 가져옵니다.
   2. z 디스크에 수직으로 선택한 사카필리 구조물 사이에 선을 그려 액티나 필라멘트 사이의 가장 짧은 거리를 측정합니다.
   3. """분석"메뉴에서"플롯 프로파일"을선택하고 두 피크 사이의 길이를 획득합니다. sarcomere 길이는 1개의 세포 안에 변화할 수 있기 때문에, 최소 20sarcomeres는 표적 세포의 다른 지역에서 측정되어야 합니다.
2. z 디스크 두께 분석
   1. 이미지 J 소프트웨어를 열고 재구성된 PALM 이미지를 가져옵니다.
   2. 재구성된 PALM 이미지를 8비트 모드 이미지로 변환합니다.
   3. 능선 감지 플러그인을 열고 다음 매개 변수를 입력 : 라인 폭 : 20, 높은 대비 : 230, 낮은 대비 : 10, 시그마 : 0.79, 낮은 임계 값 : 25.84, 최소 라인 길이 : 20.
   4. "예상 폭","확장 선"및"표시 결과"를 설정합니다.
   5. 추가 분석을 위해 결과 표에서"확인"및 사용"평균 선 너비"를 사용합니다.

결과

CM의 구조적 성숙 정도를 추정하기 위해 신생아, 완전 성숙한 성인 및 iPSC CM은 처음에 α 액틴 항체로 CM을 표시하여 사코메르 네트워크를 시각화했다. PALM 수집 후 이미지를 재구성하고 개별 필라멘트의 폭을 자동으로 감지하기 위해 플러그인 기반 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 z 디스크 두께를 측정했습니다. Sarcomere 길이는 인접한 필라멘트에 해당하는 두 개의 인접한 강도 피크 사이의 거리를 측정하여 계산되었습니다. 도 1은 iPSC 유래 CM에서 사컴레 조직의 평가를 나타낸다.

도 2A에제시된 바와 같이, iPSC-CM 및 신생아 세포는 불규칙하고 분리된 사코레 구조를 가진 유사한 α-액티닌 패턴을 나타내는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 정량적 평가는 α 액티닌 필라멘트의 길이와 두께가 거의 동일하다는 것을 보여주었으며 이는 iPSC CM의 조기 발달 ...

토론

시험관 내 기능성 iPSC 유래 CM의 생성은 재생 치료, 질병 모델링 및 약물 선별 플랫폼의 개발에 중요합니다. 그러나, 이러한 CM의 불충분 한 성숙은 심장 혈관 연구에서 주요^{장애물이다 20.} 이와 관련하여 iPSC 유래 CM의 구조적 성숙 상태를 모니터링할 수 있는 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 동시에, 슈퍼 분해능 현미경 검사는 최근 티틴 및^,트로포닌(10,^10,21,22)에대해 입증된 바와 같이 적절한 사커메르 형성에 필요한 특정 단백질의 기능을 정확하게 분석하는 귀중한 도구가 될 수 있다.

현재 프로토콜에서는 α 액틴 사코메르 네트워크를 분석하여 iPSC CM의 구조적 성숙도를 정량적으로 평가하는 PALM 기반 접근법을 제시합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
소 혈청 알부민	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	시그마 알드리치	C40-1G
사이클로옥타테트라ene	시그마 알드리치	138924-1G
시스테아민	시그마 알드리치	30070-10g
Ca2+ 및 Mg2+가 없는 둘베코의 인산염 완충 식염수	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
피지 이미지 처리 소프트웨어(이미지 J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
염산	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 시스템	Zeiss
파라포름알데히드	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin 항체 [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689