Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

백색 지방 조직(WAT)은 포유류의 에너지 저장을 위한 주요 위치를 나타냅니다. 이 조직 내에서 지방 세포 또는 "지방 세포"는 트리글리세라이드 형태로 과도한 칼로리를 저장하며, 이는 큰 단안 지질 방울로 포장됩니다. 또한, 지방세포는 에너지 항상성의 다양한 측면을 조절하는 다양한 인자를 분비합니다 ^1,2,3. 지방세포는 WAT 부피의 대부분을 구성합니다. 그러나 지방세포는 WAT ^4,5에서 발견되는 전체 세포의 50% 미만만 차지합니다. WAT의 비지방세포 구획 또는 기질-혈관 분획(SVF)은 매우 이질적이며 혈관 내피 세포, 조직 거주 면역 세포, 섬유아세포 및 지방세포 전구세포(APC) 집단을 포함합니다.

WAT는 에너지 저장에 대한 수요가 증가함에 따라 규모를 확장할 수 있는 놀라운 능력이 탁월합니다. WAT에 지질을 적절하게 저장하면 비지방 조직으로의 유해한 이소성 지질 침착을 방지할 수 있으므로 이러한 조직 가소성을 유지하는 것이 필수적이다⁶. 개별 WAT 저장소가 과잉 칼로리에 대응하여 이러한 팽창을 겪는 방식은 비만 환경에서 인슐린 감수성을 결정하는 중요한 요인이다⁷. 대사 증후군이 있는 비만 개체에서 관찰되는 병리학적 WAT 확장은 대사적으로 유리한 피하 지방 조직을 희생하면서 내장 WAT 저장소의 우선적인 확장을 특징으로 합니다. 또한, 비만에서 인슐린 저항성은 WAT의 병리학적 리모델링과 관련이 있습니다. 이것은 기존 지방 세포의 비대 성장(크기 증가), 부적절한 혈관 신생, 만성 대사 염증, 세포 외 기질 구성 요소의 축적(섬유증) 및 조직 저산소증을 특징으로 합니다 ^8,9. 이러한 비만의 WAT 표현형은 지방이영양증(기능적 WAT의 부재) 상태에서 관찰되는 것과 유사하게 간 지방증 및 인슐린 저항성과 관련이 있습니다. 대조적으로, 건강한 WAT 확장은 대사적으로 건강한 비만 인구에서 관찰되며, 지방세포 증식을 통한 보호적인 피하 WAT의 우선적 확장 및 저장소 확장이 특징이다¹⁰. 새로운 지방세포의 모집은 지방세포 전구세포(APC)에서 새로운 지방세포 분화(de novo adipocyte differentiation)에 의해 매개됩니다("지방형성"이라고 함). 지방세포 증식은 WAT 섬유증 및 대사 염증의 정도가 상대적으로 낮은 것과 일치합니다 ^6,11. WAT 미세환경 내의 다양한 세포 유형은 비만에서 WAT의 건강과 확장성에 직접적인 영향을 미친다¹². 따라서 WAT에 존재하는 다양한 세포 유형의 기능을 정의하는 것은 이 분야의 높은 우선 순위로 남아 있습니다.

지난 10년 동안 인간 및 마우스 WAT SVF¹³에서 네이티브 APC를 정의하고 격리하기 위해 몇 가지 전략이 채택되었습니다. 이러한 전략은 항체 기반 세포 분리 기술을 사용하여 일반적인 중간엽 줄기/전구 세포 마커의 세포 표면 발현을 기반으로 APC를 분리합니다. 이러한 접근법에는 형광 활성화 세포 분류(FACS), 형광단 표지 항체 사용 또는 면역자기 비드 분리(즉, 화학적으로 변형된 항체)가 포함됩니다. APC의 분리를 대상으로 하는 세포 표면 단백질에는 PDGFRα, PDGFRβ, CD34 및 SCA-1이 포함됩니다. 이러한 접근 방식은 APC를 강화하는 데 도움이 되었습니다. 그러나 이러한 마커를 기반으로 분리된 세포 집단은 매우 이질적입니다. 매우 최근의 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 연구는 murine WAT 14,15,16,17의 분리된 기질-혈관 분획(SVF) 내에서 기질 세포의 분자 및 기능적 이질성을 강조했습니다. 자체 scRNA-seq 및 기능 분석을 통해 성체 마우스의 복강 내 WAT의 기질 구획에서 기능적으로 구별되는 면역 조절 및 지방형성 PDGFRβ+ 혈관 주위 세포 하위 집단을 식별하고 특성화했습니다¹⁵. 섬유-염증 전구체(Fibro-inflammatory precursors, FIPs)는 PDGFRβ+ 세포의 두드러진 부분집단을 나타내며 LY6C 발현(LY6C+ PDGFRβ+ 세포)을 기반으로 분리할 수 있습니다¹⁵. FIP는 지방형성 능력이 부족하고, 다양한 자극에 대해 강력한 전염증 반응을 일으키며, 콜라겐을 생성하고, 항지방형성 인자를 분비한다¹⁵. 이러한 세포의 전염증성 및 섬유화 활성은 생쥐의 비만과 관련하여 증가하며, 이는 이러한 세포가 WAT 리모델링의 조절자로 연루됩니다. LY6C- CD9- PDGFRβ+ 부분집단은 지방세포 전구세포(APC)를 나타냅니다. 이러한 APC는 Pparg 및 기타 지방유발 유전자의 발현이 풍부하며, in vitro 및 in vivo¹⁵에서 성숙한 지방세포로 쉽게 분화할 수 있다. 여기에서는 FACS를 사용하여 성체 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 이러한 별개의 세포 집단을 분리하고 비오틴화 항체를 사용한 면역자성 비드 분리를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 성체 남성 및 여성 마우스의 여러 복강 내 WAT 저장소에서 기능적으로 구별되는 지방 전구 세포 하위 집단을 분리하는 데 사용할 수 있습니다¹⁵. 이러한 기능적으로 구별되는 세포 집단을 고립된 상태에서 연구하는 것은 건강과 질병에서 지방 형성 및 복강 내 지방 조직 리모델링을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 현재의 이해에 크게 기여할 수 있습니다.

아래 프로토콜은 쥐 부고환 WAT에서 지방 전구 세포의 분리에 대해 자세히 설명합니다. 그러나, 동일한 절차를 사용하여 수컷 및 암컷 마우스 모두의 장간막 및 후복막 WAT 저장소로부터 해당 세포를 분리할 수 있다¹⁵. 마우스에서 이러한 저장소를 식별하고 격리하는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 Bagchi et ^al.18에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 생후 6-8주 된 마우스의 사용에 최적화되었습니다. APC의 빈도 및 분화 능력은 노화와 관련하여 감소할 수 있습니다.

모든 동물 프로토콜 및 절차는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터 기관 동물 사용 및 관리 위원회(University of Texas Southwestern Medical Center Institutional Animal Use and Care Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 생식선 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리

1. 6-8주 된 쥐의 생식선 백색 지방 조직을 절개하고 지방 패드를 1x PBS 용액에 넣습니다.
2. 최대 4개의 지방 저장소(1-2마리의 마우스에서 2-4개 저장소 권장)를 결합하고 200μL의 분해 완충액(1x HBSS, 1.5% BSA 및 1mg/mL 콜라겐분해효소 D)이 들어 있는 10mL 비커에 조직을 다집니다.
3. 다진 조직을 10mL 분해 완충액이 들어 있는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4. 혼합물을 37°C의 수조에서 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
5. 100μm 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다.
6. 여과된 샘플을 2% FBS가 포함된 PBS를 사용하여 30mL로 희석하고 4°C에서 5분 동안 600 x g 으로 원심분리합니다. 성숙한 지방 세포를 포함하는 상층액을 흡인합니다.
7. 선호하는 세포 분리 방법으로 즉시 진행합니다.

2. FACS를 사용한 APC 및 FIP 격리

1. 튜브를 부드럽게 흔들어 펠릿을 1x RBC 용해 완충액 1mL에 녹입니다.
2. 실온에서 1-2분 동안 배양합니다.
3. 2% FBS/PBS 10mL를 넣고 40μm 세포 여과기를 통해 깨끗한 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
4. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 매체를 흡입하고 Fc 블록을 포함하는 2% FBS/PBS 400-800 μL에 펠릿을 재현탁시킵니다(1:200).
6. 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.
7. mL당 ≤10-6^{개의 세포를} 포함하는 400 μL-800 μL의 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브에 옮기고 항체를 추가합니다. 항체 농도는 Table of Materials(재료 표 ) 섹션에 나열되어 있습니다.
   1. 1) 염색되지 않은 세포, 2) 단색 대조군 및 3) FMO(형광 마이너스 1) 대조군을 위한 별도의 대조 튜브를 준비합니다.
   2. PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C 항체로 샘플을 염색합니다.
8. 4 °C에서 15분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.
9. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
10. 400μL의 2% FBS/PBS에서 배지를 흡인하고 세포를 재현탁시킵니다.
11. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
12. 배지를 흡인하고 400-800 μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 40μm 필터 캡을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 통과시켜 FACS를 만듭니다.
13. 게이팅을 위해 다음 단계를 따르십시오.
    1. 보정을 위해 염색되지 않은 단색 컨트롤을 사용하십시오.
    2. FMO 컨트롤을 사용하여 실험 게이트를 설정합니다.
    3. 그림 1에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 APC 및 FIP를 얻을 수 있습니다. 게이트 APC는 CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- 및 FIP는 CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ 세포로 게이트합니다.
14. 500μL의 100% 혈청이 들어 있는 튜브에서 분류된 세포를 수집하고 세포를 얼음 위에 유지합니다.
15. 600 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 셀을 원심 분리합니다. 2% FBS/PBS를 추가하여 4°C에서 5분 동안 600 x g 에서 다시 원심분리하여 세포를 세척합니다. 상층액을 버리고 펠릿 세포를 사용하십시오.
16. 펠릿화된 세포를 적절한 부피의 생식선 APC 배양 배지(세포 배양용) 또는 후속 분석을 위한 적절한 완충액에 재현탁시킵니다.

3. adipogenic 및 non-adipogenic fractions의 면역자기 분리

1. 1.1-1.7 단계에 따라 생식선 백색 지방 조직에서 SVF를 분리합니다.
2. 상층액을 흡입하고 SVF 펠릿을 10mL의 시판되는 1x MS 버퍼에 재현탁시킵니다.
3. 40μm 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다.
4. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 상층액을 흡인하고 펠릿 세포를 100μL의 1x MS 완충액에 재현탁시킵니다.
6. 아래 설명된 대로 CD31⁺ 및 CD45⁺ 세포 고갈을 수행합니다(그림 2A, 1단계). 이것은 내피 및 조혈 계통 세포를 제거하기 위해 수행됩니다.
   1. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 세고 농도를 ≤ 1 x 10⁸ cells/mL로 조정합니다.
   2. 비오틴 접합 CD31 및 CD45 항체를 10⁶ 세포 당 ≤ 0.25 μg의 농도로 세포 현탁액에 추가하고 15분 동안 얼음에서 배양합니다.
   3. 4mL의 1x MS 버퍼를 첨가하여 세포를 세척합니다.
   4. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   5. 상층액을 흡입하고 100μL의 1x MS 완충액으로 펠릿을 재현탁시킵니다.
   6. 10μL의 스트렙타비딘 나노비드를 넣고 15분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다.
   7. 4mL의 1x MS 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다.
   8. 600 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 흡입합니다.
   9. 2.5mL의 1x MS 완충액에 세포를 재현탁하고 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
   10. 튜브를 자석 랙에 5분 동안 놓습니다.
   11. 세포 현탁액을 깨끗한 15mL 원심분리 튜브에 주입하여 라벨이 없는 세포를 수집합니다.
       알림: 원치 않는 세포 분획으로 인한 오염으로 이어질 수 있으므로 매달려 있는 방울을 흔들거나 잘라내지 마십시오.
   12. 자석에서 튜브를 제거하고 3.6.9단계를 반복합니다. 을 3.6.11로 변경합니다. 두 번 더 세탁하면 총 3회 세탁할 수 있습니다.
7. adipogenic 및 non-adipogenic fraction의 분리(그림 2A, 2단계)
   1. 라벨링되지 않은 분획(즉, CD45-CD31^-분획)으로 작업을 계속합니다.
   2. 라벨링되지 않은 세포가 들어 있는 15mL 튜브를 600 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   3. 상층액을 흡인하고 펠릿을 100μL의 1x MS 완충액에 재현탁시킵니다.
   4. 비오틴 접합 LY6C 및 CD9 항체를 각각 10⁶ 세포 당 ≤ 0.25 μg의 농도로 첨가하고 얼음에서 15 분 동안 배양합니다.
   5. 3.6.3단계를 수행합니다. 을 3.6.12로 변경합니다. 두 번째 분리를 완료합니다.
   6. 결합되지 않은 분수를 수집합니다. 표지되지 않은 세포(LY6C^- CD9^-)는 APC를 포함하는 지방 분획을 나타냅니다(그림 2A, 단계 3).
   7. 자석에서 튜브를 제거하고 1x MS 버퍼에서 결합된 셀을 재현탁 및 용리합니다. 용리액 또는 표지된 분획(LY6C⁺ CD9⁺)은 FIP를 포함하는 비지방성 분획을 나타냅니다(그림 2A, 3단계).
   8. 600 x g 에서 5분 동안 라벨링 및 라벨링되지 않은 분획을 원심분리하여 4°C에서 펠릿 셀로 이동합니다.
8. 즉시 세포 배양을 진행하거나(6단계) 선호하는 분석을 위해 미분화 전구체를 사용합니다(4단계 및/또는 5단계).

4. 유세포 분석을 통한 지방형성 및 비지방성 분획의 순도 평가

1. Fc 블록을 포함하는 2% FBS/PBS의 200-400 μL에 비드 분리 세포 분획을 재현탁시킵니다(1:200).
2. 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.
3. 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮기고 항체를 추가합니다. 항체 농도는 재료 표에 나와 있습니다.
   1. 1) 염색되지 않은 세포, 2) 단색 대조군 및 3) FMO 대조군을 위한 별도의 대조 튜브를 준비합니다.
   2. 샘플에 CD45, CD31, CD9 및 LY6C 항체를 추가합니다.
4. 4 °C에서 15분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.
5. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. 상층액을 흡인하고 400μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다.
7. 600 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다.
8. 상층액을 흡인하고 400-800 μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다. 유세포 분석을 위해 40μm 필터 캡을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 여과합니다.
9. 순도를 평가하기 위한 유세포 분석
   1. 보정을 위해 염색되지 않은 단색 컨트롤을 사용하십시오.
   2. FMO 컨트롤을 사용하여 실험 게이트를 설정합니다.
   3. 그림 2B와 같이 라이브 셀과 단일 셀에 대해 gating 전략을 사용합니다.
   4. CD45, CD31, LY6C 및 CD9에 대해 그림 2B 와 같이 게이팅을 수행합니다.
   5. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분리 분획 내에서 CD45-CD31-LY6C-CD9^- 세포(APC) 및 CD45-CD31-LY6C⁺ 세포(FIP)의 빈도를 평가할 수 있습니다.

5. FIP 및 APC의 순도를 평가하기 위해 정량적 PCR을 사용한 유전자 발현 분석

1. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 자기 또는 FACS 분리 세포에서 mRNA를 추출합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 역전사 효소 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 1μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
3. SYBR green PCR master mix를 사용하여 정량적 PCR로 APC 및 FIPs 선택적 유전자(표 1)의 상대적 mRNA 수준을 측정합니다.
   1. 2x SYBR 녹색 염료 5μL, cDNA 1μL(~50ng/μL), 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.5μL(10μM) 및 물 3μL와 같이 PCR에 대한 샘플 반응을 설정합니다.
   2. 정량적 PCR 실행을 위해 다음 표준 PCR 조건을 사용하십시오: 홀드 스테이지: 2분 동안 50°C, 10분 동안 95°C; PCR 스테이지(40 사이클): 95°C에서 15초, 60°C에서 1분
4. ΔΔ-Ct를 계산하여 가사 유전자(Rps18) 수준으로 값을 정규화합니다.
5. 통계적 유의성을 평가하려면 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 수행합니다.

6. 세포 배양 및 분화

1. 4 °C에서 5분 동안 600 x g 에서 자기 또는 FACS 절연 셀을 원심분리합니다.
2. 500 μL의 생식선 APC 배양 배지에 펠릿을 재현탁시키고 48웰 배양 플레이트의 각 분획에서 40K 세포/웰을 플레이트합니다.
3. 1-2일마다 미디어를 교체하십시오. APC는 합류점에 접근함에 따라 지방세포로 분화하기 시작합니다. 동일한 매체에서 유지되는 FIP는 지방 형성을 겪지 않습니다.

이 프로토콜은 성체 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 뚜렷한 기질 세포 집단을 분리할 수 있는 두 가지 전략을 설명합니다. APC 및 FIP는 FACS(그림 1) 또는 비오틴화 항체를 사용한 면역자성 비드 분리(그림 2)로 분리할 수 있습니다. 두 접근법 모두 상업적으로 이용 가능한 시약과 항체를 사용합니다. 면역자성 비드 분리는 gWAT SVF에서 지방형성 세포와 비지방성 세포를 분리합니다. 유세포 분석 결과 지방 분획 내 세포의 75%가 LY6C-CD9-APC를 나타내는 것으로 나타났습니다. >지방생성되지 않은 분획의 75%는 FIP(LY6C+ 세포)를 나타냈습니다.

그림 1: FACS에 의한 생식선 WAT에서 PDGFR β + 기질 세포 부분집단의 분리. (A) 절차의 개략도: 기질 혈관 분획(비지방세포 세포)은 효소 조직 분해 및 원심분리에 의해 성숙한 지방세포에서 분리되었습니다. 그런 다음 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 내피(CD31+) 및 조혈(CD45+) 계통 세포를 제거하고 LY6C+ PDGFRβ+ 세포(FIP) 및 LY6C-CD9-PDGFRβ+ 세포(APC)를 분리했습니다. (B) 대표적인 FACS 수집 게이트. 패널 A는 허가를 받아 ref.11에서 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 면역자성 비드 분리에 의한 지방형성 및 비지방성 기질 세포의 분리. (A) 절차의 개략도: 1단계: CD31+ 및 CD45+ 셀이 자석에 결합합니다. 이것은 내피 세포와 조혈 계통 세포를 모두 제거합니다. CD31- 및 CD45- 세포를 함유하는 용출액을 채취한 후 각각 LY6C 및 CD9를 인식하는 항체로 배양하였다. 2단계: 자석에 결합하는 CD9+ 및 LY6C+ 세포. 단계 3: CD9- 및 LY6C- 세포를 포함하는 상층액(결합되지 않은 분획)을 지방 분획(APC)을 나타내므로 수집했습니다. 나노구에 결합된 비지방성 CD9+ 및 LY6C+ 세포는 FIP를 포함하는 비-APC 분획으로 용출되었습니다. (B) 지방형성 및 비지방형성 분획 내에서 APC(LY6C-CD9-) 및 FIP(LY6C+)의 빈도를 각각 평가하기 위한 유세포 분석 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

광학 현미경 및 유전자 발현 분석은 FAC에 의해 또는 6-8주령 마우스의 gWAT에서 자성 비드 분리를 통해 분리한 APC가 Gonadal APC 배양 배지에서 세포의 초기 도금 후 7-10일 이내에 높은 수준으로 지질 함유 지방세포로 분화되었음을 보여줍니다(그림 3). 대조적으로, 비지방형성 전구체(예: 섬유-염증성 전구체 또는 FIP)는 섬유아세포와 유사하게 유지되었으며 동일한 배양 배지(Gonadal APC 배양 배지)에서 유지될 때 지방세포가되지 않았습니다(그림 3). non-APCs 배양에서 약간의 지질 축적을 보인 세포는 거의 없다는 점에 유의해야 합니다(그림 3D). 이는 세포 분리 중 APC 오염으로 인해 발생할 수 있습니다. 추가 세척은 이 분획의 순도를 향상시킬 수 있습니다.

그림 3: 성체 마우스의 gWAT에서 분리한 PDGFR β + 기질 세포 집단의 시험관 내 분화. (서기-인도) 6-8주 된 마우스 gWAT SVF에서 면역자기 비드 분리(A-B) 또는 FACS(C-D)로 분리한 분화된 기질 세포 하위 집단의 대표적인 명시야 이미지. 이미지는 Gonadal APC 배양 배지에서 세포를 도운장한 후 7일 후에 촬영되었습니다. 도금 후 7-10일 이내에 APC는 자발적인 지방 세포 분화를 겪습니다. 배율 10X. 스케일 = 250 μM. (E-F) A-D에 표시된 분화된 배양에서 지방 세포 선택 유전자의 mRNA 수준. 막대 그래프는 평균 + SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: FIP 및 APC의 분리를 검증하는 데 사용되는 qPCR 프라이머 염기서열

T.A.P.는 Novo Nordisk A/S의 직원이자 주주입니다.