여기에서는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 기반 기술을 사용하여 면역 체계에서 관심 유전자를 knockout하는 방법과 CD40(Cluster of differentiation 40) 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 이러한 마우스의 평가를 설명합니다.
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방법 논문
여기에서는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 기반 기술을 사용하여 면역 체계에서 관심 유전자를 knockout하는 방법과 CD40(Cluster of differentiation 40) 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 이러한 마우스의 평가를 설명합니다.
면역 체계는 박테리아 및 바이러스와 같은 외부 침입자로부터 인간을 방어하는 기능을 합니다. 그러나 면역 체계의 장애는 자가면역, 염증성 질환 및 암으로 이어질 수 있습니다. 염증성 장 질환(IBD)인 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)은 장 염증이 재발하는 만성 질환입니다. IBD는 서구 국가(1,000명 중 1명)에서 가장 많이 발생하지만, 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다. 연관성 연구를 통해 연구자들은 수백 개의 유전자를 IBD의 병리학과 연결시켰습니다. 그러나 IBD의 이면에 있는 정교한 병리학과 많은 수의 잠재적 유전자는 최상의 치료 표적을 찾는 데 상당한 어려움을 제기합니다. 또한 각 유전적 연관성을 기능적으로 특성화하는 데 필요한 도구는 각 유전자에 대해 유전적으로 변형된 마우스의 생성과 같은 많은 속도 제한 요인을 도입합니다. 표적 유전자의 치료 가능성을 조사하기 위해 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 기반 기술과 CD40(Cluster of Differentiation 40) 작용성 항체를 사용하여 모델 시스템을 개발했습니다. 본 연구는 면역 체계에서 CRISPR/Cas9 매개 편집이 in vivo 유전자의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 조혈 구획에 국한된 이 접근법은 결과적으로 재구성된 면역 체계를 안정적으로 편집합니다. CRISPR/Cas9 편집 마우스는 기존의 유전자 변형 마우스보다 더 빠르게 생성되고 훨씬 저렴합니다. 또한, 마우스의 CRISPR/Cas9 편집은 배아에 치명적인 표적을 평가할 수 있는 능력과 같이 유전자 변형 마우스를 생성하고 번식시키는 것에 비해 상당한 과학적 이점이 있습니다. CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 CD40을 모델 타겟으로 사용하는 이 연구는 이 접근법의 타당성을 입증합니다.
자가면역질환은 환자의 면역체계가 자신의 세포와 장기를 공격하여 만성 염증과 조직 손상을 초래하는 상태를 말합니다. 현재까지 약 100가지 유형의 자가면역 질환이 보고되었으며, 이는 전체 인구의 3-5%에 영향을 미칩니다1. 전신 홍반성 루푸스(redupus erythematosus) 및 IBD를 포함한 많은 자가면역 질환은 효과적인 치료법이 부족하고 충족되지 않은 상당한 의학적 수요를 제시합니다. 현재 미국에서만 약 150만 명이 앓고 있는 IBD는 진행성, 지속성, 재발성 장 염증을 특징으로 하는 파괴적인 질병으로, 치료법은 없습니다. IBD 환자가 필요로 하는 새로운 치료 및 예방 전략을 제공하기 위해서는 근본적인 병인과 병태생리학을 규명하는 것이 필요합니다 2,3.
게놈 전체 연관 분석(GWAS)을 통해 230개 이상의 서로 다른 IBD 유전자좌가 확인되었습니다4. 이러한 연관성을 통해 IBD의 주요 메커니즘과 경로에서 잠재적으로 중요한 역할을 할 수 있는 새로운 유전자가 밝혀졌지만, 이러....
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이 프로토콜에 따라 수행되는 모든 동물 실험은 해당 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명된 모든 절차는 AbbVie IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 필요한 렌티바이러스의 생성 및 기증자 및 수혜 동물의 조달
참고: 재료 표에는 이 프로토콜에 사용되는 모든 동물, 기구 및 시약에 대한 출처 및 주문 번호 세부 정보가 포함되어 있습니다.
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상술한 절차에 따라, CD40-targeted gRNA를 발현하는 마우스를 생성하였다. 2주차까지 B 세포, CD11b+ 대식세포 및 CD11c+ 수지상 세포(DC)가 생착되었습니다(그림 2). 그러나 이전 문헌18에 근거한 예상대로 T 세포는 완전히 생착하는 데 더 오래 걸렸고 ~90%에 도달하기 위해서는 생착 후 12주가 걸렸습니다(그림 2). 비장과 림프절과 같은 면역 기관은 기증자 유래 세포가 가장 눈에 띄게 분포되어 있었다. 그러나 간, 폐, 장을 포함한 다른 장기에서도 공여 세포의 존재가 나타났습니다(그림 3). CD40 발현의 급격한 감소는 CD40 표적 gRNA를 발현하는 마우스에서만 관찰되었습니다(그림 4
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여기에 표시된 결과는 이 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 유전자 기능을 조사할 수 있는 새로운 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 플랫폼을 소개합니다. 세포 분류는 유전자 변형 LSK 세포 풀을 풍부하게 하여 단 4개월 만에 재구성된 동물 내에서 CD40 발현을 90% 이상 감소시켰습니다. 또한, 면역 체계 내에서 CD40의 발현 감소는 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델 내에서 지대한 영향을 미쳐 질병 종점을 크게 줄였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 in vivo CRISPR/Cas9 기반 플랫폼이 구축되었으며, 이는 연구자들에게 면역 체계 내 유전자의 기능을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 기술 발전은 새로운 표적 생물학을 검증하는 프로세스를 가속화하고, 궁극적으로는 IBD 및 자가면역 환자에게 혁신적인 치료법을 제공할 수 있는 능력을 촉진할 것입니다.
여기에 제시된 CRISPR/C.......
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이 연구를 위한 설계, 연구 수행 및 재정 지원은 애브비(AbbVie)에서 제공했습니다. 애브비는 데이터 해석, 검토 및 출판물 승인에 참여했습니다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
이 작업을 지원해 주신 Ruoqi Peng, Donna McCarthy, Jamie Erikson, Liz O'Connor, Robert Dunstan, Susan Westmoreland 및 Tariq Ghayur에게 감사드립니다. WT C57Bl/6 마우스에서 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델을 확립하는 데 리더십을 발휘해 주신 Rajesh Kamath 및 기타 사람들을 포함한 약리학 리더들에게 감사드립니다. 또한, 체내 실험을 지원하는 AbbVie Bioresearch Center와 Cambridge Research Center의 Comparative Medicine East Department에서 근무하는 모든 분들께 감사드립니다.
CRISPR 시약[CRISPR/Cas 시스템을 사용한 멀티플렉스 게놈 엔지니어링]을 제공해 주신 Broad Institute의 Zhang 연구실과 Massachusetts Institute of Technology의 McGovern Institute of Brain Research에 감사드립니다. 콩, L, 란, FA, 콕스, D, 린 S, 바레토, R, 하비브 N, 슈 PD, 우 X, 장 W, Marraffini LA, 장 F 과학. 2013....
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6-웰 조직 배양 플레이트 | Corning/Costar | #3506 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300/5/6 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| 0.45 µ m 필터 장치 | Millipore | #SLHV013SL | |
| 0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-060-C-S | |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15mL 원추형 | VWR | 21008-918 | |
| 23 G 니들 | VWR | #305145 | |
| 24 웰 Non-TC 플레이트 | Falcon | #351147 | |
| 24-웰 TC 플레이트 | Falcon | #353047 | |
| 50 mL 원추형 튜브 | VWR | 21008-951 | |
| 5 mL 주사기 | BD Biosciences | #309647 | |
| 70 µ m 필터 | Miltenyi | #130-098-462 | |
| 96-Well Flat Bottom Plates | Corning | #3599 | |
| 96-Well U-Bottom Plates | Corning/Costar | #3365 | |
| Anesthesia Machine | VetEquip - COMPAC5 | #901812 | |
| Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody | BioXcell | BE-0016 | |
| Anti-p40 monoclonal antibody | BioXcell | BE-0051 | |
| B220 PE 항체 | BioLegend | #103208 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Cas9 Knock-in Mice | Jackson Labs | #026179 | C57Bl/6 background |
| CD117+ Beads | Miltenyi | #130-091-224 | |
| CD11b PE 항체 | BioLegend | #101208 | |
| CD3 PE 항체 | BD Biosciences | #553240 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter | Allegra 6KR 원심분리기 | |
| 조리대 원심분리기 | Eppendorf | 원심분리기 5424 | |
| DPBS | ThermoFisher | #14190136 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Mediatech | #10-013-CV | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | AM9260G | |
| Endoscope | Karl Storz | N/A | Custom Coloview Tower |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt-L) | PeproTech | #250-31L | |
| Gr-1 PE 항체 | BD Biosciences | #553128 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher | #14170120 | |
| Heat-Inactivated Fetal bovine Serum | HyClone | #SH30071.03 | |
| IL-7 | PeproTech | #217-17 | |
| Incubator | Binder | #9040-0116 | |
| Isoflurane | HenrySchein | #6679401710 | |
| LS Column | Miltenyi | #130-042-041 | |
| Ly5.1 Pepboy Mice | Jackson Labs | #002014 | C57Bl/6 background |
| mouse stem cell factor (mSCF) | PeproTech | #250-03 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Hospira | #00409488850 | |
| OPTI-MEM 무혈청 배지 | Invitrogen | #31985-070 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 (PenStrep) | ThermoFisher | #15140-122 | |
| 플레이트 셰이커 | ThermoFisher | #88880023 | |
| pLentiPuro | Addgene | #52963 | |
| 폴리브레네 (10 &마이크로; g/&마이크로; L) | Sigma Aldrich | #TR-1003-G | |
| 적혈구 용해 완충액 | eBioscience | #00-4333 | |
| Retronectin | Takarbio | #T100B | |
| Sca-1 APC 항체 | BioLegend | #108112 | |
| StemSpan | StemCell Technologies | #09600 | |
| Ter119 PE 항체 | eBioscience | #12-5921 | |
| 트롬보포이에틴(TPO) | PeproTech | #315-14 | |
| X선 조사기 | 정밀 X선 | X-Rad 320 |
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