방법 논문

CRISPR/Cas9 기반 기술을 이용한 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델의 표적 유전자 기능 조사

DOI:

10.3791/61618

⸱

2021년 6월 2일

 ,  , 
1AbbVie, Cambridge Research Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 기반 기술을 사용하여 면역 체계에서 관심 유전자를 knockout하는 방법과 CD40(Cluster of differentiation 40) 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 이러한 마우스의 평가를 설명합니다.

초록

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면역 체계는 박테리아 및 바이러스와 같은 외부 침입자로부터 인간을 방어하는 기능을 합니다. 그러나 면역 체계의 장애는 자가면역, 염증성 질환 및 암으로 이어질 수 있습니다. 염증성 장 질환(IBD)인 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)은 장 염증이 재발하는 만성 질환입니다. IBD는 서구 국가(1,000명 중 1명)에서 가장 많이 발생하지만, 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다. 연관성 연구를 통해 연구자들은 수백 개의 유전자를 IBD의 병리학과 연결시켰습니다. 그러나 IBD의 이면에 있는 정교한 병리학과 많은 수의 잠재적 유전자는 최상의 치료 표적을 찾는 데 상당한 어려움을 제기합니다. 또한 각 유전적 연관성을 기능적으로 특성화하는 데 필요한 도구는 각 유전자에 대해 유전적으로 변형된 마우스의 생성과 같은 많은 속도 제한 요인을 도입합니다. 표적 유전자의 치료 가능성을 조사하기 위해 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 엔도뉴클레아제(Cas9) 기반 기술과 CD40(Cluster of Differentiation 40) 작용성 항체를 사용하여 모델 시스템을 개발했습니다. 본 연구는 면역 체계에서 CRISPR/Cas9 매개 편집이 in vivo 유전자의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 조혈 구획에 국한된 이 접근법은 결과적으로 재구성된 면역 체계를 안정적으로 편집합니다. CRISPR/Cas9 편집 마우스는 기존의 유전자 변형 마우스보다 더 빠르게 생성되고 훨씬 저렴합니다. 또한, 마우스의 CRISPR/Cas9 편집은 배아에 치명적인 표적을 평가할 수 있는 능력과 같이 유전자 변형 마우스를 생성하고 번식시키는 것에 비해 상당한 과학적 이점이 있습니다. CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 CD40을 모델 타겟으로 사용하는 이 연구는 이 접근법의 타당성을 입증합니다.

서론

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자가면역질환은 환자의 면역체계가 자신의 세포와 장기를 공격하여 만성 염증과 조직 손상을 초래하는 상태를 말합니다. 현재까지 약 100가지 유형의 자가면역 질환이 보고되었으며, 이는 전체 인구의 3-5%에 영향을 미칩니다1. 전신 홍반성 루푸스(redupus erythematosus) 및 IBD를 포함한 많은 자가면역 질환은 효과적인 치료법이 부족하고 충족되지 않은 상당한 의학적 수요를 제시합니다. 현재 미국에서만 약 150만 명이 앓고 있는 IBD는 진행성, 지속성, 재발성 장 염증을 특징으로 하는 파괴적인 질병으로, 치료법은 없습니다. IBD 환자가 필요로 하는 새로운 치료 및 예방 전략을 제공하기 위해서는 근본적인 병인과 병태생리학을 규명하는 것이 필요합니다 2,3.

게놈 전체 연관 분석(GWAS)을 통해 230개 이상의 서로 다른 IBD 유전자좌가 확인되었습니다4. 이러한 연관성을 통해 IBD의 주요 메커니즘과 경로에서 잠재적으로 중요한 역할을 할 수 있는 새로운 유전자가 밝혀졌지만, 이러한 유전자 자리에서 발견된 유전자는 몇 개에 불과합니다. 일부 유전자는 특정 경로와 관련이 있습니다. 예를 들어, 미생물 감지 경로는 뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인 함유 단백질 2(NOD2)와 연결되어 있습니다. 자가포식 경로는 자가포식 관련 16 like 1(ATG16L1), 면역 관련 GTPase family M(IRGM) 및 caspase recruitment domain family member 9(CARD9)와 관련이 있습니다. 전염증 경로는 인터루킨(IL)-23에 의한 T세포 반응과 관련이 있다4. GWAS 5,6을 통해 확인된 유전자를 기능적으로 특성화하기 위해 다양한 in vivo 마우스 모델이 사용되었습니다.

IBD 발병기전 7,8을 연구하는 데 사용되는 주요 모델 중 하나는 대장염의 CD40 모델로, 면역 결핍(T 세포 및 B 세포) 마우스에 CD40 작용 항체를 주입한 후 선천성 면역 장 염증을 유발합니다. 주로 대식세포와 수지상 세포9와 같은 IBD 발달에 대한 선천성 면역의 기여도를 조사하는 데 주로 사용되며, 완전한 면역 능력을 갖춘 야생형(WT) 마우스에서 질병이 유발될 수 있는지는 불분명합니다. 동물 모델 외에도 화합물 및 생물학적 제제를 포함한 유전자의 기능적 특성화를 위해 유전자 특이적 도구도 필요합니다. 더 중요한 것은, 유전자 변형 동물은 특정 유전자의 기능을 밝히는 데 필수적이라는 것이다. 그러나 유전자 변형 쥐를 만드는 데 일반적으로 사용되는 전략(배아 주입 및 번식)은 종종 1년 이상이 걸리고 상당한 재정적 비용이 발생합니다. 이러한 속도 제한 과정은 GWAS에 의해 확인된 IBD 관련 유전자의 기능을 규명하는 데 있어 중요한 도전을 제시합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 유전자 변형 마우스를 육종하는 것에 대한 실행 가능한 대안을 제공합니다. 먼저, 그림 1 개략도에서 볼 수 있듯이, 계통 음성, 줄기세포 항원1 양성, 수용체 티로신 키나아제 키트 양성(계통-Sca1+c-Kit+ 또는 LSK) 세포를 특정 대립유전자(CD45.2)를 가진 Cas9 knockin(KI) 마우스의 골수에서 분리하여 공여자 면역 세포를 추적할 수 있습니다. 다음으로, 이러한 세포는 형질도입된 세포를 추적할 수 있도록 다양한 가이드 RNA(gRNA)와 형광 마커인 Violet-excited green fluorescent protein(VexGFP)을 지닌 렌티바이러스에 노출됩니다. 이틀 후, VexGFP+ 세포를 분류하여 치사량으로 방사선 조사된 수용자 Ly5.1 Pep Boy 마우스(CD45.1 대립유전자를 가진 C57Bl/6 마우스)에 주입하여 수용자 면역 세포를 추적할 수 있습니다. 12주 후, 면역 체계가 완전히 재구성되고 마우스는 생체 내 모델에 등록할 수 있습니다.

유전자 변형 동물의 생성 및 사육에 비해 비용 절감 및 생성 시간 단축이라는 이점 외에도 이 방법론은 특히 조혈 구획을 표적으로 하기 때문에 배아에 치명적인 표적에 이상적입니다. 또한 항체와 같이 사용할 수 있는 도구가 없는 표적의 경우 이 시스템은 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 요약하면, 지금까지 설명한 문제를 해결하기 위해 유전자 변형 동물 모델을 신속하게 생성하기 위해 생체 내 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 플랫폼이 개발되었습니다 10,11,12,13,14. 이 연구는 WT C57Bl/6 마우스의 장 염증이 CD40 작용 항체에 의해 유발될 수 있음을 보여줍니다. CD40은 이 모델에서 질병의 핵심 조절자이므로 CRISPR/Cas9 기반 knockout 및 유전자 기능 상실을 검증하기 위한 모델 타겟으로 사용되었습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에 따라 수행되는 모든 동물 실험은 해당 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명된 모든 절차는 AbbVie IACUC의 승인을 받았습니다.

1. 필요한 렌티바이러스의 생성 및 기증자 및 수혜 동물의 조달

참고: 재료 표에는 이 프로토콜에 사용되는 모든 동물, 기구 및 시약에 대한 출처 및 주문 번호 세부 정보가 포함되어 있습니다.

  1. VexGFP 또는 mCherry로 변형된 lentiGuide-puro 벡터를 사용하여 플라스미드를 구성합니다.
    1. 스크램블된 non-targeting gRNA (SgNone) 또는 CD40-targeting gRNA를 modified vector에 클로닝합니다.
      참고: 이 연구에서 각 gRNA의 염기서열은 다음과 같습니다: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; 및 SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
    2. 앞서 설명한 바와 같이 렌티바이러스 입자를 생성한다15.
      1. gRNA 인코딩 플라스미드를 VSV-G 및 pLEX 패키징 플라스미드를 사용하여 293T 세포로 동시 transfection합니다.
      2. 형질주입 18시간 후에 배양 배지를 변경하고 배지 변경 후 24-48시간 후에 바이러스를 포함하는 상층액을 수집합니다.
      3. CD40 gRNA의 효율을 평가하기 위해 CD40을 인코딩하는 pcDNA3.1 플라스미드의 transfection을 통해 CD40 안정 293T 세포주를 생성하십시오.
    3. 설명된 렌티바이러스를 사용하여 세포를 transfection하고 2주 후에 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)로 평가합니다.
      참고: Cas9 KI 마우스는 기증자 마우스로 사용되었습니다. C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy 마우스(CD45.1 대립유전자를 발현)를 수용자로 사용할 때 Cas9 KI 마우스가 C57Bl/6 배경에 있는지(그리고 CD45.2 대립유전자를 발현하고 있는지) 확인하여 GvHD를 피하고 공여체 및 수용자 세포를 추적합니다.
  2. 실험을 설계합니다. 유전자 knockout(KO)의 경우 유전자당 3-6개의 gRNA를 사용합니다. 각 gRNA에 대해 이식 중 및 이식 후의 동물 손실을 설명하기 위해 20%의 추가 수용 마우스를 준비합니다.
    참고: CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델은 통계적 강화를 위해 그룹당 최소 8마리의 마우스가 필요합니다. 따라서 본 연구에서는 gRNA당 10마리의 마우스를 준비했습니다. 다른 in vivo 모델에 필요한 마우스의 수는 사용된 모델에 따라 다릅니다.
  3. 생후 8-12주령의 동성 기증자 및 수혜자 마우스를 사용합니다.
    참고: 마우스는 최소 5%의 이소플루란을 사용하여 IACUC 승인 지침에 따라 안락사되었으며 2차 방법으로 자궁경부 탈구로 확인되었습니다.

2. 골수 채취 및 세포 분류를 위한 준비

  1. 집게와 가위를 사용하여 각 기증자 마우스(대퇴골, 경골, 상완골 및 척골)에서 뼈를 채취하여 가능한 한 많은 근육/조직을 조심스럽게 제거합니다.
  2. 0.6mL 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 23G 바늘로 구멍을 뚫고 튜브를 1.5mL 원심분리기 튜브 안에 넣습니다. 동물당 2세트를 만드십시오.
  3. 뼈의 한쪽 끝을 잘라내고 열린 끝이 23G 바늘 구멍을 향하도록 미세 원심분리기 튜브 내부에 4-8개의 뼈를 넣습니다.
    참고: 튜브당 뼈의 수는 뼈에 따라 다릅니다(예: 8개의 경골, 상완골 및 척골 또는 4개의 대퇴골이 맞습니다).
  4. 튜브(1.5mL 원심분리 튜브 내부에 뼈가 들어 있는 0.6mL 마이크로 원심분리기 튜브 포함)를 실온(RT)에서 300× g으로 2 분 동안 원심분리합니다.
  5. 이제 골수가 없는 뼈가 들어 있는 0.6mL 마이크로 원심분리기 튜브를 버리고 1.5mL 원심분리기 튜브만 골수로 가득 채웁니다. 각 원심분리 튜브에 적혈구 용해 완충액(염화암모늄 함유) 1mL를 추가하고 피펫팅으로 세포 펠렛을 재현탁합니다. RT에서 1분 동안 배양합니다. 필요한 경우 용해 단계를 반복합니다.
  6. 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 옮기고 칼슘과 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 추가하여(세포 현탁액 부피의 최소 두 배) 용해 완충액을 중화합니다. 펠렛 셀을 300 × g 에서 5 분 동안 가열합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.
  7. 50mL 코니컬 튜브에 70μm 필터를 로드하고 DPBS를 사용하여 튜브와 필터를 세척하여 세포를 필터링합니다. 필터를 버리고 셀을 계산합니다.
    참고: 30마리의 기증자 마우스(12주령)를 사용하면 평균적으로 200-300× 106 개의 세포를 얻을 수 있습니다.

3. 형질도입을 위해 LSK 세포를 분리하기 위한 세포 분류

  1. 2.7단계에서 계수된 세포를 자기 세포 분류(MACS) 완충액(DPBS, 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산, 0.5% 소 혈청 알부민, 10μg/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 원하는 부피(107 개 세포당 90μL)로 다시 현탁합니다.
  2. 10 7 cells당 10 μL의 CD117+ bead를 추가합니다. 잘 섞어 빛을 피하고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 자기장에 컬럼을 배치하고 MACS 버퍼로 헹궈 MACS LS 컬럼을 준비합니다.
  4. 3.2단계의 세포를 적절한 부피의 MACS 버퍼(최소 부피의 두 배)로 세척하고 300×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다.
  5. 상층액을 완전히 흡인합니다. 최종 농도가 500μL의 MACS 완충액에서10 8 세포가 되도록 펠릿을 다시 현탁합니다.
  6. 세포 현탁액을 LS 컬럼에 적용합니다. 3mL의 MACS 버퍼로 3회 세척합니다.
    참고: 하나의 LS 열은 최대 10개의 8개의 레이블이 지정된 셀과 2개의 × 109 개의 총 셀을 사용할 수 있습니다.
  7. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 수집 튜브에 넣습니다. MACS 완충액 5mL를 추가하고 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 세포를 즉시 씻어냅니다.
  8. 300 × g 에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.
  9. 107 cells당 100 μL의 MACS buffer에 세포를 재부탁하고 계통(CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) 및 Sca-1에 대한 염색 항체를 추가합니다.
    참고: 30마리의 기증자 마우스(12주령)를 사용하면 평균적으로 100-180× 10개의6 개 세포를 얻을 수 있습니다.
  10. 잘 섞어 빛을 피하고 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
  11. 5-10mL의 MACS 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고 300×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.
  12. 500 μL의 MACS 버퍼에 최대 10개의8 세포 재현탁
  13. 70μm 세포 스트레이너로 세포를 필터링하고 lineage-Sca1+ 집단에 대해 FACS를 수행합니다.
    참고: 인구의 약 1.8-2.6%는 혈통-Sca1+이어야 합니다.
  14. LSK 배양 배지(세포 10,000개당 100μL)에서 세포 수집: 무혈청 팽창 배지, 100ng/mL 트롬보포이에틴, 마우스 줄기세포 인자, Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드 및 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 IL-7.
  15. 펠렛 셀을 300 × g 에서 10 분 동안 가열합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다.

4. 대조군 및 녹아웃 세포를 생성하기 위한 LSK 형질도입 및 배양

  1. LSK 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
  2. LSK 배양 배지의 96웰 편평한 바닥 조직 배양(TC) 플레이트에 웰당 10,000개의 세포를 시딩합니다.
  3. 무균 조건에서 37°C에서 5% CO2 및 95% 습도로 밤새 배양합니다.
  4. DPBS에서 50μg/mL 레트로넥틴 용액을 준비하고 TC가 처리되지 않은 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 300μL를 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
  5. 다음날 레트로넥틴 용액을 버리고 코팅된 플레이트를 300μL의 DPBS로 헹구고 반복합니다.
  6. 500μL의 배지(4.2단계에서 96웰 플레이트의 5웰)에 있는 50,000개의 LSK 세포를 4.4단계에서 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 레트로넥틴 코팅된 웰로 옮깁니다. 5웰당 100μL의 LSK 배지를 추가로 사용하여 96웰 플레이트에 남아 있는 여분의 세포를 헹구고 수집합니다. 이 단계에 따라 24웰 플레이트의 웰당 부피가 600μL인지 확인합니다(96웰 플레이트에서 5 × 100μL 웰 + 5웰을 세척하는 데 사용되는 100μL).
    참고: 이식 후 현미경으로 비어 있는 24웰 플레이트를 보고 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다. LSK 배지를 사용하여 전달되지 않은 세포를 수집하여 이 작은 집단에서 세포 손실을 최소화합니다.
  7. 각 웰에 바이러스 상등액 300μL를 넣고 500의 설정값으로 플레이트를 5분 동안 흔듭니다. 600 × g 및 37 ° C에서 20 분 동안 플레이트를 돌립니다. mL당 최소 5 × 106 개의 바이러스 입자를 사용합니다.
    참고: 이 연구에서는 pLentiPuro에서 변형된 벡터를 사용하여 퓨로마이신 저항성 요소를 VexGFP로 교체했습니다. 이 바이러스는 50-100의 감염 다중으로 추가되었습니다.
  8. 1시간 동안 배양합니다. 예열된 LSK 배지 500μL를 추가합니다.
  9. 무균 조건에서 37 ° C에서 5 % CO2 및 95 % 습도로 2 일 동안 배양합니다.

5. 기증자 줄기세포 생착을 위한 동물 방사선 조사

  1. 배양 2일 후, 수혜 동물에게 4시간 간격으로 475 cGy를 2회 조사합니다. 2차 방사선 조사 후, 동물을 고압멸균 케이지에 넣고 12주 동안 면역 결핍 동물로 치료합니다. 생쥐는 필요에 따라 지지적인 보살핌과 개입을 제공하기 위해 농축, 하이드로겔 및 케이지 측면 모니터링을 받았습니다. 생쥐는 지지 치료 및 중재 방법 외에도 항생제 음식이나 물을 투여받을 수 있습니다.
    메모. 방사선 조사량은 조사기에 따라 다를 수 있습니다. 방사선 조사기의 용량 적정을 수행하여 최상의 용량을 식별합니다. C57Bl/6 마우스에 대한 700 - 1300 cGy 사이의 용량은 다양한 문헌 실시예17에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 범위에서 3-4 용량을 선택하고 용량당 5 마리의 마우스를 생존 및 생착 상태로 평가합니다. 생착에 실패하거나 방사선 선량이 너무 높으면 생착 후 3주를 넘기지 못합니다. 생착 후 4주가 지나면 FACS에 의한 생착을 평가하기 위해 살아남은 쥐의 출혈을 평가합니다. 생착을 평가하기 위해 마우스당 ~50-100μL의 후안와(RO) 혈액 채취를 수행합니다. 마우스는 채혈 중 마취(2-3% 이소플루란)를 받았고 RO 혈액 채취 후 지지 치료로 안구 윤활제와 1.0mL 피하 식염수를 받았습니다.

6. 세포 준비 및 방사선 조사된 수용 동물에 주입

  1. 4.9단계에서 각 웰에서 세포를 파이펫으로 빼내고, 세포가 다른 gRNA로 transduction되었으므로 그룹을 분리한 후 300 × g 에서 10분 동안 펠릿화합니다.
  2. MACS 버퍼에서 세포를 재현탁하고, 70μm 스트레이너로 필터링하고, VexGFP+ 집단을 정렬합니다.
    참고: 셀의 약 10-15%는 VexGFP+여야 합니다.
  3. 300 × g 에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. Hank의 균형 잡힌 염 용액에 재현탁시킵니다: 200μL에서 마우스당 5,000개 이상의 세포.
    참고: HBSS는 비제약 등급입니다. 주사를 위해 제약 등급의 멸균 식염수를 사용하는 것도 고려할 수 있습니다.
  4. 마지막 방사선 조사 후 3시간 후에 세포를 정맥 주사합니다.
    참고: 12주 후, 마우스는 완전히 생착된 면역 체계를 갖게 되며 생체 내 모델에 등록할 수 있습니다.

7. 야생형 마우스의 CD40 작용 항체 유발 대장염 모델

참고: 매일 동물의 무게를 측정하고 평가하십시오. 필요에 따라 지지 관리 제공: 체중이 10% 감소하거나 탈수된 경우 피하 염화나트륨 용액 1.0mL. 이 모델에 대한 양성 대조군은 -1일차부터 일주일에 두 번 25mg/kg으로 복강내 투여되는 항-p40입니다.

참고: 이 연구에서 실험 그룹에는 순진한 대조군, 차량(음성) 대조군 및 anti-p40(양성) 대조군이 포함되었습니다. 이 그룹들은 함께 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델의 정상적인 행동을 제어합니다. 벡터, SgNone 및 SgRNA 그룹: 일반적인 렌티바이러스 벡터에 대한 벡터 대조군인 SgNone은 스크램블된 비표적 가이드 대조군이며, SgRNA 그룹은 표적 gRNA의 발현이 감소된 "치료" 그룹입니다.

  1. 0일차: 순진한 대조군을 제외한 모든 동물에게 DPBS에서 10mg/kg의 CD40 작용성 항체를 복강내 주사합니다.
  2. 3일차 및 6일차: 앞서 설명한 바와 같이 질병 진행을 평가하기 위해 비디오 내시경 검사를 수행합니다16.
    1. 2-3% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 회복하는 동안 내부 마취 기계 메커니즘 및/또는 외부 열 패드를 통해 열 지원을 제공합니다.
    2. 생쥐가 마취되면 DPBS(칼슘 및 마그네슘 없음) 관장을 투여하여 내시경 검사를 위해 결장을 준비합니다.
      참고: 관장을 수행하려면 약 1-2mL가 필요합니다.
    3. 관장 후 마취 상태에서 마우스를 마취 기계의 콧방울로 이동합니다.
    4. 내시경을 결장에 부드럽게 삽입하고, 카메라를 중앙에 놓고 결장을 공기로 팽창시킨 상태에서 근위 결장으로 천천히 전진한 다음(동봉된 공기 펌프를 사용하거나 튜브/주사기를 부착하여 수동으로 팽창시킴), 내시경을 천천히 빼내고 항문에서 3cm, 2cm, 1cm 떨어진 곳에서 비디오와 이미지를 수집합니다.
      알림: 결장의 자극을 최소화하기 위해 내시경 끝에 멸균 윤활제를 첨가할 수 있습니다.
    5. 표 1에 설명된 대로 혈관 패턴과 점막의 두꺼워짐을 기준으로 각 이미지에 개별적으로 점수를 매깁니다. 마우스당 3개 이미지의 점수를 결합하여 각 동물에 합계 점수를 할당합니다.
  3. 7일차: 이소플루란 과다 투여 또는 CO2 챔버로 모든 마우스를 안락사시키고 혈청용 심장 천자로 가능한 한 많은 혈액을 수집합니다. 비장 비대를 측정하기 위해 비장의 무게를 측정하고 유세포 분석을 위해 수집하고 조직 병리학을 위해 결장을 수집합니다.
    참고: 마우스 결장의 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직 절편을 제조하여 Wang etal 19에 의해 이전에 기술된 바와 같이 면역조직화학(IHC)에 사용했습니다.

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결과

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상술한 절차에 따라, CD40-targeted gRNA를 발현하는 마우스를 생성하였다. 2주차까지 B 세포, CD11b+ 대식세포 및 CD11c+ 수지상 세포(DC)가 생착되었습니다(그림 2). 그러나 이전 문헌18에 근거한 예상대로 T 세포는 완전히 생착하는 데 더 오래 걸렸고 ~90%에 도달하기 위해서는 생착 후 12주가 걸렸습니다(그림 2). 비장과 림프절과 같은 면역 기관은 기증자 유래 세포가 가장 눈에 띄게 분포되어 있었다. 그러나 간, 폐, 장을 포함한 다른 장기에서도 공여 세포의 존재가 나타났습니다(그림 3). CD40 발현의 급격한 감소는 CD40 표적 gRNA를 발현하는 마우스에서만 관찰되었습니다(그림 4

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토론

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여기에 표시된 결과는 이 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델에서 유전자 기능을 조사할 수 있는 새로운 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 플랫폼을 소개합니다. 세포 분류는 유전자 변형 LSK 세포 풀을 풍부하게 하여 단 4개월 만에 재구성된 동물 내에서 CD40 발현을 90% 이상 감소시켰습니다. 또한, 면역 체계 내에서 CD40의 발현 감소는 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델 내에서 지대한 영향을 미쳐 질병 종점을 크게 줄였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 in vivo CRISPR/Cas9 기반 플랫폼이 구축되었으며, 이는 연구자들에게 면역 체계 내 유전자의 기능을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 기술 발전은 새로운 표적 생물학을 검증하는 프로세스를 가속화하고, 궁극적으로는 IBD 및 자가면역 환자에게 혁신적인 치료법을 제공할 수 있는 능력을 촉진할 것입니다.

여기에 제시된 CRISPR/C...

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공개 사항

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이 연구를 위한 설계, 연구 수행 및 재정 지원은 애브비(AbbVie)에서 제공했습니다. 애브비는 데이터 해석, 검토 및 출판물 승인에 참여했습니다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업을 지원해 주신 Ruoqi Peng, Donna McCarthy, Jamie Erikson, Liz O'Connor, Robert Dunstan, Susan Westmoreland 및 Tariq Ghayur에게 감사드립니다. WT C57Bl/6 마우스에서 CD40 작용성 항체 유발 대장염 모델을 확립하는 데 리더십을 발휘해 주신 Rajesh Kamath 및 기타 사람들을 포함한 약리학 리더들에게 감사드립니다. 또한, 체내 실험을 지원하는 AbbVie Bioresearch Center와 Cambridge Research Center의 Comparative Medicine East Department에서 근무하는 모든 분들께 감사드립니다.

CRISPR 시약[CRISPR/Cas 시스템을 사용한 멀티플렉스 게놈 엔지니어링]을 제공해 주신 Broad Institute의 Zhang 연구실과 Massachusetts Institute of Technology의 McGovern Institute of Brain Research에 감사드립니다. 콩, L, 란, FA, 콕스, D, 린 S, 바레토, R, 하비브 N, 슈 PD, 우 X, 장 W, Marraffini LA, 장 F 과학. 2013년 1월 3일].

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-웰 조직 배양 플레이트Corning/Costar#3506
TransIT-LT1Mirus BioMIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyi Biotec130-091-221
0.45 µ m 필터 장치Millipore#SLHV013SL
0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브AxygenMCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf TubeAxygenMCT-150-C-S
15mL 원추형VWR21008-918
23 G 니들VWR#305145
24 웰 Non-TC 플레이트Falcon#351147
24-웰 TC 플레이트Falcon#353047
50 mL 원추형 튜브VWR21008-951
5 mL 주사기BD Biosciences#309647
70 µ m 필터Miltenyi#130-098-462
96-Well Flat Bottom PlatesCorning#3599
96-Well U-Bottom PlatesCorning/Costar#3365
Anesthesia MachineVetEquip - COMPAC5#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibodyBioXcellBE-0016
Anti-p40 monoclonal antibodyBioXcellBE-0051
B220 PE 항체BioLegend#103208
소 혈청 알부민Sigma AldrichA7906-100G
Cas9 Knock-in MiceJackson Labs#026179C57Bl/6 background
CD117+ BeadsMiltenyi#130-091-224
CD11b PE 항체BioLegend#101208
CD3 PE 항체BD Biosciences#553240
원심분리기Beckman CoulterAllegra 6KR 원심분리기
조리대 원심분리기Eppendorf원심분리기 5424
DPBSThermoFisher#14190136
Dulbecco' s Modified Eagle MediumMediatech#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)InvitrogenAM9260G
EndoscopeKarl StorzN/ACustom Coloview Tower
유세포 분석기BD BiosciencesFACS Aria II
Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt-L)PeproTech#250-31L
Gr-1 PE 항체BD Biosciences#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)ThermoFisher#14170120
Heat-Inactivated Fetal bovine SerumHyClone#SH30071.03
IL-7PeproTech#217-17
IncubatorBinder#9040-0116
IsofluraneHenrySchein#6679401710
LS ColumnMiltenyi#130-042-041
Ly5.1 Pepboy MiceJackson Labs#002014C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)PeproTech#250-03
Sodium chloride (NaCl)Hospira#00409488850
OPTI-MEM 무혈청 배지Invitrogen#31985-070
페니실린-스트렙토마이신 (PenStrep)ThermoFisher#15140-122
플레이트 셰이커ThermoFisher#88880023
pLentiPuroAddgene#52963
폴리브레네 (10 &마이크로; g/&마이크로; L)Sigma Aldrich#TR-1003-G
적혈구 용해 완충액eBioscience#00-4333
RetronectinTakarbio#T100B
Sca-1 APC 항체BioLegend#108112
StemSpanStemCell Technologies#09600
Ter119 PE 항체eBioscience#12-5921
트롬보포이에틴(TPO)PeproTech#315-14
X선 조사기정밀 X선X-Rad 320

참고문헌

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