자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색

요약

자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.

초록

면역조직화학은 특정 조직 구조와 단백질 발현 및 국소화를 시각화하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 염색 절차 동안 조직 섹션을 처리하기 위해 두 가지 대체 접근법이 널리 사용되며, 한 가지 접근법은 유리 슬라이드에 직접 섹션을 장착하는 것으로 구성되며, 두 번째 접근 방식 인 자유 부유는 용액에 현탁 된 동안 고정 된 섹션을 유지하고 염색 할 수 있습니다. 슬라이드 장착 및 자유 부동 접근법은 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 자유 부유 기술은 더 나은 항체 침투를 허용하므로 실험의 초점이 뇌 영역의 수지상 및 축삭 투영에 대한 정보를 얻는 것과 같이 조직의 3D 재구성에 더 두꺼운 섹션을 사용해야 할 때 선택 방법이어야 합니다. 또한, 섹션이 용액에 보관되기 때문에, 단일 부분 표본은 30 내지 40 개의 섹션을 쉽게 수용 할 수 있으며, 특히 대규모 생물 의학 연구에서 취급이 덜 힘들다. 여기에서는 뇌 절편에 중점을 둔 형광 면역조직화학 염색에 자유 부유 방법을 적용하는 방법을 설명합니다. 또한 조직 샘플이 일반적으로 파라포름알데히드 또는 포르말린으로 적절하게 고정되는 한 자유 부동 기술을 연구자의 개별 요구에 맞게 쉽게 수정하고 헤마톡실린, 에오신 및 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학 기반 염색뿐만 아니라 다른 조직에 적용할 수 있는 방법에 대해서도 논의할 것입니다.

서론

면역 염색은 130 년 전 1890 년 Von Behring¹에 의해 혈청 항체가 발견되면서 시작된 인기있는 연구 관행입니다. 20^세기 초^{에는 반응1}을 정량화하고 시각화하는 방법으로 항원에 염료가 부착되었고 나중에는 항체에 부착되었으며, 1941년 Albert Coons는 광학 현미경 ^2,3에 혁명을 일으킨 최초의 형광 항체 라벨을 개발했습니다. 용어 "면역염색"은 웨스턴 블롯, 유세포분석, ELISA, 면역세포화학, 및 면역조직화학^3,4를 포함하여^, 이 원리를 사용하여 개발된 많은 기술을 포함한다. 웨스턴 블롯은 조직 또는 세포 추출물에서 특정 단백질의 존재를 감지합니다⁵. 단백질은 겔 전기 영동을 사용하여 크기별로 분리되고, 막으로 옮겨지고, 항체를 사용하여 프로빙됩니다. 이 기술은 단백질의 존재와 단백질의 양을 나타냅니다. 그러나 세포 나 조직 내에서 단백질의 국소화에 대한 정보는 밝히지 않습니다. 또 다른 방법인 면역세포화학(ICC....

프로토콜

1. 냉동 절제를위한 조직 준비

1. 적절한 매립 몰드(재료 표 참조)에 고정 조직을 삽입하여 적절한 표본 매트릭스(재료 표 참조)를 사용하여 표본 블록을 만들고 드라이아이스에서 얼립니다. 절단할 준비가 될 때까지 시편 블록을 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 고정 조직은 일반적으로 사용 가능한 윤리적 허가에 따라 성인(약 2.5 – 30개월) 수컷 또는 암컷 설치류(마우스 또는 쥐)³⁴를 적절한 고정제(예: 10% 포르말린)로 관류한 다음 동일한 고정액에 4°C에서 12시간 동안 고정 후 조직을 1x PBS로 3회 세척하여 준비합니다. 조직을 1x PBS에 15% 및 30% 슈크로스에 밤새 또는 조직이 가라앉을 때까지³⁵에 배치합니다. 연구원은이 일반 프로토콜을 다른 개발 단계에 적용하려고 할 수 있습니다.

2. 냉동 제거

1. 절편할 준비가 되면 절편 전에 최소 1-2시간 동안 저온 유지 장치에서 샘플을 순응시켜 조직의 산산조각이 나지 않도록 합니다.
2. 저온 유지 장치를 사용하여 조직을 섹션(20-50μm)으로 절단하고 1x PBS 용....

결과

자유 부유 방법을 사용하여 형광 면역조직화학 분석을 수행하는 전체 도식이 도 1에 예시되어 있다. 마우스 뇌에서 자유 부유법을 이용한 형광 IHC의 대표적인 예는 신경교섬유산성 단백질(GFAP) 발현을 조사하여 염색의 전반적인 품질을 설명하기 위해 더 낮은 배율 및 높은 배율 모두에서 도 2에 나타내었다. 이 접근법은 그림 3에 표시된 GFP 저발현 형질전환 마우스 뇌의 예와 같이 저발현 단백질을 드러내는 데에도 적합합니다. 자유 부동 방법은 프로토콜의 1단계부터 4.3단계까지 수행한 다음 6단계에 표시된 대로 섹션을 장착하여 그림 4와 같이 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학적 염색 프로토콜에서도 사용할 수 있습니다. 그 후, 섹션은 슬라이드 장착 섹션이 필요한 임의의 염색을 사용하여 처리될 수 있다. 발색 IHC.......

토론

면역조직화학(IHC)은 조직 절편 내에서 단백질 발현 및 국소화를 식별하는 데 중요한 역할을 하는 다목적 기술입니다. 이 분석은 질병 상태에 대한 정상 기능 단계에 걸쳐 조직의 특성을 더 깊이 이해하기 위해 과학계 전체에서 사용됩니다. IHC는 암과 같은 질병의 임상 진단에서 전임상 연구^10,36의 초기 발견에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 사용됩니다.

IHC를 수행하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 슬라이스된 후 섹션이 슬라이드에 즉시 부착되는 슬라이드 장착 방법입니다. 이 기술을 사용하면 연구원이 단백질 공동 국소화 연구에 필요한 매우 얇은 섹션을 처리하고 슬라이드 당 섹션을 염색하는 데 거의 용액을 사용할 수 없다는 장점이 있습니다. 항체는 종종 비싸다. 따라서 이 접근 방식은 처리해야 하는 섹션이 거의 없는 경우 경제적인 옵션이 될 수 있습니다. 이것은 또한 조.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	Corning	3513
6웰 플레이트	Corning	3516
투명 매니큐어	사용자 선호	사항 해당 없음
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding moulds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	사용자 환경설정	N/A
포르말린 용액	Fisher Scientific	SF98-4
말 혈청, 열 비활성화	Gibco	26050088
현미경 슬라이드 박스	전자 현미경 서비스	71370
PBS	사용자 선호도	N/A
기본 항체	사용자 선호도	N/A
직사각형 커버슬립	VWR	48393-081	24 x 50 mm
직사각형 염색 접시	전자 현미경 서비스	70312
라운드 아티스트 붓 # 2	Princeton Select Series	3750R	브랜드 중요하지 않음
2 차 항체	사용자 환경 설정	N / A
임베딩을위한 표본 매트릭스	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
얼룩 트레이 – 슬라이드 염색 시스템	전자 현미경 서비스	71396-B	어두운 뚜껑
사용 Sucrose	사용자 환경 설정	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	사용자 환경 설정	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	12
웰 플레이트용 비경화 웰 인서트	Corning Netwells	3477
6웰 플레이트용 웰 인서트	Corning Netwells	3479
Whatman 여과지	Millapore-Sigma	WHA1440042