여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.
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방법 논문
잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.
서론
동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.
선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에
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프로토콜
1. 칼슘 이미징까지 웜 재배
- 칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다.
- 이 NGM 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 4일 동안 인큐베이션한다(표 재료).
2. 하드웨어 설정
- 자극용 압전 장치(13), 2x 대물렌즈, 고속 sCMOS 카메라, 이미지 분할 광학, xy 전동 스테이지, 여기를 위한 LED 광원 및 컴퓨터가 장착된 현미경을 준비합니다(그림 1). sCMOS 카메라의 필수 사양에는 인터페이스 옵션으로 10 탭 카메라 링크가 포함 된 2560 x 2160 활성 픽셀, 6.5 μm 크기. X-Y 전동 스테이지의 주요 사양에는 110mm x 75mm 이동 범위, 25....
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결과
여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(그림 7)도 정량화되었다. 변위는 진동 제어를 위한 소프트웨어(그림 3B)와 증폭기의 볼륨 조절기(그림 4)의 진폭 값을 설정하여 제어할 수 있는 반면, 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조절됩니다(그림 4).
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토론
일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나노스케일 변위(13)의 국부적 진동을 불러일으키는 이전에 개발된 방법과 결합하여, 여기에 예시된 것은 제어된 진동에 반응하는 억제되지 않은 C. elegans 의 비침습적 칼슘 이미징을 위한 방법이다.
기계적 자극의 특성은 주파수, 변위 및 지속 시간과 같은 몇 가지 매개 변수에 의해 정의됩니다. 최근에, 생물 tremology는 새로운 연구 분야로 부상하고있다1.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 "소프트 로봇의 과학"프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.
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재료
Nematode growth media plate
스크립트 염화륨 용 Windows7
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| DualViewImaging.nb | author | 수집된 데이터 분석 | |
| Mathematica12 | Wolfram | 데이터 분석 소프트웨어 DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. 대장균 OP50 | Caenorhabditis 유전학 센터 | OP50 | C. elegans. 식품 Uracil auxotroph.E. 대장균 B. |
| lite-1(ce314) 균주 | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | 빛에 민감하지 않은 돌연변이 |
| lite-1(ce314) 균주 AVA-speciric promoter | 저자 | ST12 | lite-1(ce314) NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; 핵 국소화 신호) 및 TagRFP를 발현하는 유전자를 운반하는 돌연변이 FLP < / EM >-18 프로모터는 extrachoromosomal 어레이 |
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참고문헌
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M.
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