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방법 논문

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

2.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61626

⸱

2021년 4월 29일

 ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Institute for Quantum Life Science, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 3National Institute for Radiological Sciences, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 4JST, PRESTO

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

초록

진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.

서론

동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.

선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에 습관화된다 9,10,11. 따라서이 간단한 행동 반응은 비 국소 진동 유발 행동과 기억의 기초가되는 신경 메커니즘을 조사하는 이상적인 시스템을 구성합니다. 비국소 진동의 영향으로 자유롭게 행동하는 웜에서 칼슘 이미징을위한 프로토콜이 설명됩니다. 이전에 보고된 시스템과 비교할 때, 이 시스템은 추적을 위해 추가 카메라가 필요하지 않다는 점에서 간단합니다. 그러나 이를 통해 비국부적 진동의 주파수, 변위 및 지속 시간을 변경할 수 있습니다. AVA 인터뉴런의 활성화는 후진 탈출 반응을 유도하기 때문에, GCaMP, 칼슘 지시약, 및 칼슘-민감하지 않은 형광 단백질인 TagRFP를 공동발현하는 웜을 AVA 특이적 프로모터의 제어 하에 예로 사용하였다(자세한 내용은 표 참조). 이 프로토콜은 웜이 전진에서 후진 운동으로 전환됨에 따라 AVA 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 것을 용이하게합니다.

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프로토콜

1. 칼슘 이미징까지 웜 재배

  1. 칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다.
  2. 이 NGM 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 4일 동안 인큐베이션한다(표 재료).

2. 하드웨어 설정

  1. 자극용 압전 장치(13), 2x 대물렌즈, 고속 sCMOS 카메라, 이미지 분할 광학, xy 전동 스테이지, 여기를 위한 LED 광원 및 컴퓨터가 장착된 현미경을 준비합니다(그림 1). sCMOS 카메라의 필수 사양에는 인터페이스 옵션으로 10 탭 카메라 링크가 포함 된 2560 x 2160 활성 픽셀, 6.5 μm 크기. X-Y 전동 스테이지의 주요 사양에는 110mm x 75mm 이동 범위, 250mm/s 최대 속도, 2,000mm/s2 최대 가속도 및 0.25μm 단방향 반복성이 포함됩니다.
  2. 컴퓨터와 xy 전동 스테이지 컨트롤러를 켭니다.
  3. 앰프를 켜고 볼륨 조절기를 10으로 , 베이스 및 고음 조절기를 8로 설정합니다.
  4. GCaMP 및 TagRFP를 자극하려면 LED 광원의 488nm 및 560nm 조명을 켭니다. 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm의 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다.
    참고: 이 LED 강도에서 GCaMP 및 TagRFP 형광의 광표백은 기록 중에 발생하지 않습니다.

3. 칼슘 이미징을 위한 소프트웨어 설정

  1. Windows에서 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 특성을 제어하는 소프트웨어, 추적 소프트웨어 실행을 위한 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어(자료 표)의 세 가지 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다.
  2. 추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오.
  3. 실행 단추를 누르고 5분 동안 기다렸다가 소프트웨어를 안정화합니다(그림 2A).
  4. 노출 시간 및 비닝에 대한 정보를 제공합니다. 0.033s 노출 시간과 2 x 2 비닝으로 원활한 이미지 수집이 보장됩니다(그림 2B).
    참고: 메모리 로드를 줄이기 위해 획득한 10번째 이미지만 표시됩니다.
  5. 이미지 수집을 위한 정보를 제공합니다(그림 2C). 예를 들어 10초 간격으로 500개의 이미지가 두 번 기록되는 경우 [이미지] 합계 상자에 1,000개, [이미지] 상자에 500개, 간격 상자에 10 개를 입력합니다.
  6. 획득 단추를 켭니다(그림 2D).
  7. 이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고, 두 개의 이미지 (GCaMP 채널, 500-525 nm (도 2E); TagRFP 채널, 584-676 nm (그림 2F))는 sCMOS 카메라의 두 반쪽에 투영됩니다. GCaMP 및 TagRFP 채널의 좌표를 보정합니다(그림 2G). 소프트웨어 설정을 저장합니다.
  8. 데이터 파일을 출력하도록 디렉토리를 설정합니다(그림 2H).
  9. 획득 단추를 끕니다(그림 2D).
  10. 마우스 매크로 시스템 소프트웨어(그림 3A)를 두 번 클릭하고 진동 속성을 설정합니다(그림 3B). 마우스 매크로 시스템에서 Assay.txt 파일을 읽어 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되도록 합니다(그림 3A). 마우스 커서의 좌표(그림 3A의 자홍색 사각형)를 설정하고 기록을 시작한 후 자극이 시작될 때까지 대기 시간(그림 3A의 마젠타)을 설정합니다. 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정합니다(그림 3B).

4. 칼슘 이미징을위한 웜의 제조

  1. GCaMP 및 TagRFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 대장균 OP50이 줄무늬가 있는 새로운 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다.
  2. 투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 압전 음향 트랜스듀서에 부착합니다(그림 4). 액추에이터 위로 플레이트를 누르지 마십시오. 이 경우 진동 주파수가 변경됩니다.

5. 특정 진동 특성의 제어하에 칼슘 이미징

  1. 획득 단추를 켭니다(그림 2D).
  2. 밝은 빛과 여기 빛 (488nm 및 560nm)에서 웜을 찾으십시오.
  3. 현미경의 확대/축소 값을 2.5배로 설정합니다. 시야각은 1.1mm x 1.1mm이며 해상도는 2.6μm/픽셀입니다.
  4. 밝은 빛을 끄고 호밍 버튼(그림 2I)을 켜서 웜의 형광 지점을 추적합니다. 이 호밍 버튼은 X-Y 스테이지의 이동을 시작하여 TagRFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다.
    참고 : flp-18 프로모터의 관점에서 AVA 뉴런의 형광 강도는 가장 강하고 다른 뉴런의 형광 강도는 희미하거나 감지되지 않습니다. 따라서 저배율 시스템은 추적에 필요하지 않으며 스테이지는 녹음 전체에서 움직입니다.
  5. 그림 2E 및 2F의 강도 막대 값이 약 1,000인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm 게이지를 미세 조정합니다.
  6. 마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 그림 3A에 설명된 일정에 따라 마우스 커서를 제어할 수 있도록 합니다. 이것은 추적 소프트웨어를 사용하여 기록하기 시작하고 웜을 추적하는 동안 파동 유전자 소프트웨어에 의해 자극됩니다.
  7. 출력 BMP 파일이 적절하게 작성되었는지 확인하십시오.

6. 데이터 분석

  1. 바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 CalciumImaging으로 지정합니다.
  2. CalciumImaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일에 대해 이름을 CIResult로 지정합니다.
  3. Windows 용 데이터 분석 소프트웨어로 작성된 DualViewImaging.nb 파일을 두 번 클릭하십시오.
  4. 파일 경로를 CIResult 폴더에 삽입합니다(예: DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]).
  5. BMP 파일(예: SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/])(그림 5)을 포함하는 폴더에 파일 경로를 삽입합니다. 여기서 XXX 는 BMP 파일을 포함하는 폴더 이름을 나타냅니다.
  6. Shift 키와 Return 키를 동시에 눌러 자동 분석을 시작합니다. 이 분석은 TagRFP 이미지에서 시야각의 최대 강도 영역의 값을 사용합니다 (프로그램의 자세한 계산 절차는 그림 6의 범례 참조).
  7. 다음 출력 파일이 CIResult 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오.
    XXX-GCaMP.tif(모든 이미지에 대한 GCaMP 강도의 흔적을 보여주는 이미지 파일)
    XXX-GCaMP.xls (모든 이미지에서 GCaMP 강도를 나열하는 스프레드 시트 파일)
    XXX-TagRFP.tif(모든 이미지에 대한 TagRFP의 강도 추적을 보여주는 이미지 파일)
    XXX-TagRFP.xls(모든 이미지에서 TagRFP 강도를 나열하는 스프레드시트 파일)
    XXX-비율.tif(모든 이미지에 대한 비율 값의 흔적을 보여주는 이미지 파일)
    XXX 비율.xls(모든 이미지의 비율 값을 나열하는 스프레드시트 파일)

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결과

여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(그림 7)도 정량화되었다. 변위는 진동 제어를 위한 소프트웨어(그림 3B)와 증폭기의 볼륨 조절기(그림 4)의 진폭 값을 설정하여 제어할 수 있는 반면, 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조절됩니다(그림 4).

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토론

일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나노스케일 변위(13)의 국부적 진동을 불러일으키는 이전에 개발된 방법과 결합하여, 여기에 예시된 것은 제어된 진동에 반응하는 억제되지 않은 C. elegans 의 비침습적 칼슘 이미징을 위한 방법이다.

기계적 자극의 특성은 주파수, 변위 및 지속 시간과 같은 몇 가지 매개 변수에 의해 정의됩니다. 최근에, 생물 tremology는 새로운 연구 분야로 부상하고있다1...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 "소프트 로봇의 과학"프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.

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재료

Nematode growth media plate
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Data anaylsis software
DualViewImaging.nbauthor수집된 데이터 분석
Mathematica12Wolfram데이터 분석 소프트웨어 DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. 대장균 OP50Caenorhabditis 유전학 센터OP50C. elegans. 식품 Uracil auxotroph.E. 대장균 B.
lite-1(ce314) 균주Caenorhabditis Genetics CenterKG1180빛에 민감하지 않은 돌연변이
lite-1(ce314) 균주 AVA-speciric promoter저자ST12lite-1(ce314) NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; 핵 국소화 신호) 및 TagRFP를 발현하는 유전자를 운반하는 돌연변이 FLP < / EM >-18 프로모터는 extrachoromosomal 어레이
< 강> 레이저 도플러 진동계< / 강>
라제 도플러 진동계Polytec JapanIVS-500음향 변환기에 의해 생성 된 주파수 및 변위를 정량화하기 위해
Mouse macro system < / strong>
Assay.txt저자Windows
HiMacroExVectorhttps://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html
Agar purified, powderNakarai tesque01162-15를 기반으로 마우스 커서를 제어하기 위한 무료 다운로드 소프트웨어 NGM 플레이트의 제조
Bacto peptonBecton Dickinson211677NGM 플레이트의 제조
칼슘Wako036-00485NGM 플레이트의 제조
콜레스테롤Wako034-03002NGM 플레이트의 제조
di-Photassium hydrogenphosphateNakarai tesque28727-95NGM 플레이트의 제조
LB 육수, LennoxNakarai tesque20066-95E. coli< / em> OP50
황산 마그네슘 무수TGIM1890NGM 플레이트 제조
용 Dihydrogenphosphate 칼Nakarai tesque28720-65NGM 플레이트 제조
염화나트륨Nakarai tesque31320-05NGM 플레이트 제조
페트리 접시(60mm)Nunc150270NGM 플레이트 준비
용<강한>비국소화 진동 장치
증폭기LEPYLP-A7USB제어 가능한 진동으로 자극하기 위해
음향 변환기MinebeaMitsumiLVC25제어 가능한 진동으로 자극하기 위해
WaveGene Ver. 1.5Thrivehttp://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html진동 속성 제어를 위한 무료 다운로드 소프트웨어
<강한>비침습적 칼슘 이미징
2채널 벤치탑 3상 브러시리스 DC 서보 컨트롤러ThorlabsBBD202MLS203-1 스테이지용 호환 컨트롤러
479/585 nm BrightLine 이중 대역 통과 필터SemrockFF01-479/585-252채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용
505/606 nm BrightLine 이중 가장자리 표준 에피 형광 이색성 빔스플리터SemrockFF505/606-Di01-25x362채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filterSemrockFF01-512/25-252채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP)
획득용630/92 nm BrightLine 단일 대역 통과 필터SemrockFF01-630/92-252채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용Intel
Xeon CPU ES-2630 및 8GB RAM이 탑재된컴퓨터DellPrecision T7600
고속 x-y 전동 스테이지ThorlabsMLS203-1고속 XY 스캔 스테이지
이미지 분할 광학Hamamatsu photonicsA12801-01W-VIEW GEMINI에 의해 생성된 2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용 이미지 분할 광학
LED 광원CoolLEDpE-4000470nm 및 560nm 여기광 생성용
현미경OlympusMVX10
sCMOS 카메라AndorZyla
x 2 대물 렌즈OlympusMVPLAPO2XC작동 거리 20mm 및 수치 조리개 0.5
Plasmid
pKDK66 플라스미드저자pKDK66Co-injection marker
pTAK83 plasmidauthorpTAK83Plasmid for expression of TagRFP under the control  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmidauthorpTAK144 의 통제하에 NLS-GCaMP5G-NLS의 발현을 위한 플라스미드; flp-18 promoter
Tracking software
homingback.viauthorsCMOS 카메라 및 x-y 전동 스테이지의 피드백 제어를 통해 웜의 형광 반점을 추적하기 위한 SubVi 파일
LabVIEWNational instruments추적 소프트웨어 실행을 위한
LabVIEW Zyla Control ver.2.6CI.vi저자sCMOS 카메라 및 x-y 전동 스테이지의 피드백 제어를 통해 웜의 형광 스폿을 추적하기 위해
스크립트 염화륨 용 Windows7

참고문헌

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  20. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
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