우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.
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이 논문에서
요약
초록
많은 인간 신경 장애는 두뇌에 있는 신경 세포 및 신경교 세포의 변성에 기인합니다. 약리학 및 기타 치료 전략의 한계로 인해 현재 부상또는 병에 걸린 뇌에 사용할 수있는 치료법이 없습니다. 세포 교체는 신경 퇴행성 조건에 대한 유망한 치료 전략으로 나타납니다. 현재까지, 신경 줄기 세포(NSC)는 태아 조직, 인간 배아 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 성공적으로 생성되었다. 변분화 과정은 다능성 줄기 세포의 생성으로 이어지는 새로운 인간 GPI 연결 당단백질의 활성화에 의해 시작되었다. 이러한 혈액 유래 만능 줄기 세포 (BD-PSC)는 밝은 필드와 면역 형광 현미경 검사법에 의해 나타난 바와 같이 신경 표현형을 가진 세포로 시험관내에서 분화한다. 전자 현미경 검사를 통해 이러한 세포의 초구조적 분석은 그들의 원시 구조뿐만 아니라 뉴런 형 형태와 세포 극성 특성을 확인합니다.
서론
기본 및 전임상 줄기 세포 연구 방법의 개발은 신경 질환에 대한 줄기 세포 기반 치료의 임상 적용을 장려합니다. 이러한 잠재적 치료는 기능적 회복1로이어지는 인간 신경 세포의 생성 방법에 비판적으로 의존한다.
신경 줄기 세포 (NSC) 자체 갱신 하 고 성인 신경 발생 이라고 하는 프로세스에 평생 새로운 뉴런으로 분화. 만 매우 제한 된 뇌 영역 은 성인기에 신생아 뉴런을 생성 할 수있는 NsCs를 항구. 이러한 NSC는 학습과 메모리에 관여하는 성숙한 뉴런을 초래할 수 있으므로 분실되거나 손상된 뉴런을 대체할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 NSC는 제한된 양에 존재하고이 제한된 신경 발생은 청소년 발달 동안 급속하게감소2. 따라서 신경 세포의 다른 소스는 세포 치료 목적으로 고려되어야합니다.
퇴행성 신경 질환은 표준 약리학적 접근법을 사용하여 치료하기가 어렵습니다. 많은 치료 신경 장애를 수용 하기위한 새로운 치료 전략은 질병과 부상 조직의 세포 대체 요법에 기초. NSC 이식은 손상된 세포를 대체하고 유익한 효력을 제공할 수 있었습니다. 신경세포 교체를 위한 그밖 근원은 포유류 분폭물
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프로토콜
실험을 수행할 때 윤리 승인을 얻었다.
1. 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 (PBMC)
- 모든 기부자가 기관 지침에 따라 혈액을 철회하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명하도록 하십시오.
- 표준 프로토콜에 따라 숙련 된 의료 인력에 의해 건강한 기증자로부터 30 mL의 혈액을 가져 가라.
- 밀도 그라데이션 미디어를 통해 PBMC를 분리합니다. 인산염 완충식염(PBS)으로 희석된 1:1 혈액의 25mL, 30분 동안 300 x g의 원심분리기를 사용하여 10mL의 미디어를 사용하십시오.
- 파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 위상 간 층을 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기의 5mL로 10분 간 300 x g로 세척합니다.
- 카운팅 챔버를 사용하여 표준 방법으로 셀 수를 계산합니다.
2. PBMC의 표면에 교차하는 항체에 의한 인간 GPI 고정 당단백질의 활성화
- 6 x 106 단핵세포(MNC)를 15mL 튜브에 배치하고 37°C에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 가진 PBS에서 30분 동안 인간 GPI 연결 막....
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결과
결과는 이 새로운 GM 자유로운 방법이 인간 게놈에 직접 행동하지 않고 그들의 가장 원시적인 상태로 혈액 전구 세포를 되돌릴 수 있다는 증거를 제공합니다.
앞서 우리는 이전에 GPI 연결 단백질 특정 항체 교차 연결이 PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN 강화 조절을 통해 WNT, NOTCH 및 C-Kit와 같은 고도의 발달 관련 유전자의 개시를 보여주었으며, 따라서 HSC의 세대와2세대,2세대, 최종PSC의2단계로 이어지는 비차별적 과정을 개시하는 것으로나타났다.
활성화된 MNC 배양은 CD45 마이크로비드를 사용하여 면역자기 분류를 실시하였다. 이 방법으로 다시 프로그래밍할 수 없는 성숙한 혈액 세포(예를 들어, CD45 양성 세포)는 컬럼상에 유지되었지만, 재프로그래밍된 세포(CD45 네거티브 셀)를.......
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토론
본 업무에서 기재된 인간 세포를 재프로그래밍하는 비GM 방법은 비조작된 인간 말초 혈액으로부터 얻은 전 생체 생성 및 자가 갱신 PSC의 확장으로 이어지는 비분화 과정을 개시하는 GPI 연계 인간 막 당단백질 의 뒤에 있는 신호(들) 기계류의 핵 활성화에 기초한다. 이러한 세포는 적절한 배지에서 배양될 때 상이한세균층(6)에속하는 세포로 재분화할 수 있다.
이 작품에서 제시된 데이터는 신경 분화 매체에서 배양할 때 GM이 없는 생성된 BD-PSCs 세포가 완전히 다른 표현형을 획득했다는 것을 보여줍니다, 길쭉한 모양으로, 그들의 세포기관의 더 높은 발달및 세포 사이 더 복잡한 상호 작용을 설치하. 더욱이, 여기에 설명된 조건을 사용하여 재분화, 다양한 신경 혈통을 향한 신경 분화를 의미한다.
재분화 연구에서 사용하기 위해 최적의 수와 재프로그래밍 된 세포의 최고 품질을 얻.......
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공개 사항
해당 저자는 그녀가 소설 인간 GPI 연결 단백질과 관련된 특허 보유자뿐만 아니라 그녀가 공동 설립및 ACA CELL 생명 공학에 대한 작동한다고 선언합니다. 다른 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
라이너 사프리치 박사의 기억력에 전념합니다.
저자는 특히 호세 마누엘 가르시아 베르두고와 비센테 헤르란츠-페레즈가 비교 신경생물학 연구소, 생물 다양성 및 진화 생물학 연구소, 발렌시아 대학, CIBERNED, 발렌시아, 스페인에서 EM 실험 및 분석을 수행한 것에 대해 특히 감사하고 있으며, 이는 Prometeo Grant의 연구 자금 지원으로 지원되었다. 이 작품의 나머지 는 ACA 셀 생명 공학 GmbH 하이델베르크, 독일에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알부민 분획 V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-TUJ1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI 세포 생존도 키트 | Biozym | 872045 | Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다. |
| 아스코르브산, 2-인산염, 세퀴마그네스 | 시그마, 알드리치 | A8960-5G | |
| B27, 무혈청, 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| 기본 FGF 솔루션 | , Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck, Millipore | L6115-BC | 밀도 구배 매체 |
| BSA Frac V, 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | 나노 크기 마그네틱 비드 |
| 세포 계수 슬라이드 Luna | Biozym | 872010 | Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다. |
| 챔버 슬라이드 Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | 에폭시 수지 |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | 제품 생산 중단 TMS-013-B |
| GDNF 재조합 인간 | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-글루타 |
| 민 글루타르알데히드 등급 | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| 헤파린 나트륨 세포 | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| 라미닌 마우스 | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다. |
| MACS 버퍼 | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsä ulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada 디지털 카메라 | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 웰 | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 보충제 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
참고문헌
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neur....
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