캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

요약

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

초록

캡 의존성 단백질 합성은 진핵 세포에서 주요 번역 경로입니다. 다양한 생화학 적 및 유전 적 접근은 캡 의존 성 번역 및 규제의 광범위한 연구를 허용했지만,이 번역 경로의 고해상도 운동 특성화는 여전히 부족합니다. 최근에는 단일 분자 분해능으로 캡 의존형 번역 운동학을 측정하기 위한 체외 분석서를 개발했습니다. 상기 분석법은 초기 에피토프 태그폴리펩티드에 형광표지 항체 결합을 기반으로 한다. 초기 펩타이드-리보솜-mRNA 복합체를 통해 항체의 결합 및 해리를 이미징함으로써 개별 mRNA에 대한 번역 진행을 추적할 수 있다. 여기서는 mRNA 및 PEGylated 슬라이드 제제, 번역의 실시간 이미징 및 단일 분자 궤적 분석을 포함한 이 분석 방법을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 개별 캡 종속 번역 이벤트를 추적할 수 있게 해주며 개시 및 신장 속도와 같은 주요 번역 역학을 해결합니다. 분석은 뚜렷한 번역 시스템에 널리 적용될 수 있으며 캡 의존성 번역 역학 및 번역 제어 메커니즘의 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.

서론

진핵 계통에서의 번역은 주로 7-메틸구아노신(m⁷G) 캡 의존경로^1을통해 발생한다. 연구에 따르면 진핵 번역의 개시 단계는 속도 제한및 규정^2,3,4에대한 공통의 목표임을 나타낸다. 캡 의존형 번역의 메커니즘은^유전5,생화학^{6,7,8,구조9,}및 게놈¹⁰ 벌크 접근법을 사용하여 광범위하게 연구되었다. 이러한 방법은 캡 의존개시를 조절하는 다양한 메커니즘을 확인했지만, 해상도는 이기종 및 비동기 개시 이벤트에서 신호의 평균을 앙상블로 제한합니다. 최근에는 생체내 번역 이벤트가 초기 폴리펩티드(11,^12,13,14)에대한에피토프에 대한 형광 항체 결합을 측정하는 방법에 의해 시각화되었다. 그러나, 이러한 새로운 접근법은 또한 다중 형광 항체가 높은 세포내 형광 배경에서 단일 번역 이벤트를 해결할 수 있도록 초기 펩티드를 결합해야 하기 때문에 개별 개시 사건을 해결하는 능력에 제한됩니다. 많은 생물학적 상호 작용에서, 해결된 개별 운동 사건은 분자 수준에서 동기화할 수 없는 복잡한 다단계 및 반복적인 생물학 프로세스를 이해하는 중요한 통찰력을 제공했습니다. 캡 의존개시 및 규제를 더 잘 이해하기 위해서는 개별 번역 이벤트의 역학을 추적할 수 있는 새로운 방법이 필요합니다.

우리는 최근에 단 하나 분자 분해능^15를가진 캡 의존성 개시 운동학을 측정하는 체외 분석서를 개발했습니다. 이 개시 경로^3,16에관여하는 많은 공지되고 알려지지 않은 단백질 인자를 고려하여, 단일 분자 분석체는 세포인자 및 견고한 번역^{활동(17,18,19,20,21,22,23,24, 25,25)의}보존으로부터 이익을 얻는 기존의 체외 세포 없는 번역 시스템과 호환될 수 있도록 개발되었다. 또한, 세포 없는 번역 시스템의 사용은 단일 분자 관측및 이전 대량 결과 사이 더 호환 비교를 허용합니다. 이 접근법은 캡 의존개시의 기존 기계론적 프레임워크에 새로운 단일 분자 운동 통찰력의 직진 통합을 제공합니다. 단일 분자 분석방식을 확립하기 위해, 기존의 세포없는 번역 시스템은 세 가지 방법으로 변형된다: 에피토프 인코딩 서열은 리포터 mRNA의 개방 독서 프레임 (ORF)의 시작 부분에 삽입된다; 기자 mRNA의 3′ 끝은 단일 분자 검출 표면에 mRNA 최종 테더링을 용이하게하기 위해 바이오티닐화된다; 형광으로 표지된 항체는 번역 추출물로 보충된다. 이러한 수정은 기본적인 분자 생물학 기술과 일반적으로 사용할 수있는 시약만 필요합니다. 더욱이, 이러한 변형 및 단일 분자 이미징 조건은 대량 세포 없는 번역 반응의 번역 역학을^{보존한다(15).}

이 분석체(그림1)에서5′-end 캡 및 3′-end 바이오타이니드 리포터 mRNA는 유동 챔버에서 스트렙타비딘 코팅 검출 표면에 고정된다. 유동 챔버는 형광으로 표지된 항체로 보충된 세포없는 번역 혼합물로 채워져 있습니다. mRNA 번역후 약 30-40코돈 하류의 에피토프^{서열(26,27)을}위해 발생한 후, 에피토프는 리보솜 출구 터널에서 나오고 형광으로 표지된 항체와 상호 작용할 수 있게 된다. 이러한 상호 작용은 급속하고 단일 분자 형광 이미징 기술에 의한 검출을 통해 활성 세포 없는 번역 중에 단일 분자 분해능으로 번역 역학을 추적할 수 있습니다. 이 분석은 캡 의존성 번역 역학 및 규제, 특히 체외 분석에서 대량 으로 작동하는 시스템의 경우 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.

이러한 단일 분자 분석법을 확립하기 위한 전제 조건은 이전에 설명된^{방법(28)에}따라 상업적으로 사용 가능하거나 제조된 번역 추출물을 사용하여 달성될 수 있는 대량 세포 없는 번역 분석이다. 진핵 번역 추출물은 곰팡이, 포유류 및^{식물(28)을}포함한 다양한 세포로부터 얻을 수 있다. 이미징의 경우, 이 분석법은 튜닝 가능한 레이저 강도 및 사고 각도, 전동 식 샘플 단계, 동력 유체 시스템 및 샘플 온도 제어 장치가 장착된 TIRF 현미경이 필요합니다. 이러한 요구 사항은 현대 체외 단일 분자 TIRF 실험에 대한 일반적이며 다르게 달성 될 수있다. 여기에 제시된 실험은 재료표에나열된 시판되는 현미경, 소프트웨어 및 액세서리로 구성된 객관적인 유형의 TIRF 시스템을 사용합니다.

프로토콜

1. 기자 mRNA의 세대

1. "태그가 붙은" 기자 mRNA(그림2A)에대한 DNA 전사 템플릿을 생성하기 위해 N-terminus 에피토프 태그 인코딩 서열을 삽입하여 벌크 분석 "태그해제" 기자 mRNA를 인코딩하는 DNA 전사 템플릿을 수정한다.
   참고: 뛰어난 감도와 짧은 3xFLAG 태그 길이로 인해 이 분석에 3xFLAG/안티 플래그 상호 작용이 권장됩니다. 그러나, 분석은 다른 에피토프/항체 쌍과 호환된다.
2. 선형화된 DNA 템플릿과 시험관 내 전사 키트를 사용하여 태그가 지정되지 않고 태그가 지정된 RNA를 합성합니다(재료 표참조). 전형적으로, 시험관내 전사 RNA의 10-20 pmol은 체계적인 단일 분자 연구를 허용하기 위하여 후속 RNA 처리를 위해 충분합니다.
3. 제조업체의 권장 사항에 따라 M⁷G 캡핑 키트(재료 표참조)를 장착한 RNA 5′ 엔드(그림2B)를캡핑합니다.
4. 생체화 키트(재료표 참조)를 사용하여 RNA 3′엔드(도 2B)를생체티니레이트(도 2B)를 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라 생체자극키트(재료표 참조)를 이용하여 생체을 비운다. 페놀 클로로폼 추출에 의해 RNA를 정화한 다음 스핀 컬럼으로 정제합니다. RNase 가 없는 물의 10-20 μL에서 엘루트 RNA. 약 40-50%의 미제한 입력 RNA가 회수된다.
5. ^앞서설명한 바와 같이 아크릴아미드 겔 전기포고및 RNA 염색을 하여 RNA 무결성 및 농도를 평가한다.
6. 3′-말-바이오티니징 태그 리포터 mRNA와 함께 대량 세포 없는^{번역(30)을} 수행하여 수정된 mRNA가 관심 있는 번역 특성을 보존하고 있는지 확인합니다. 예를 들어, 캡 의존형 번역은 대량 세포 없는 번역 반응에서 리포터 활동을 측정하고 비교하여 확인할 수 있으며, 제한되지 않은 리포터 mRNA(대표 결과참조).

2. 플로우 챔버 준비

1. 현미경 목표 사양 시트에 의해 지정된 적절한 커버슬립 두께를 선택합니다. 각각 목표 또는 프리즘 형 총 내부 반사 형광(TIRF) 이미징^{시스템(31)에}대한 유리 또는 석영 슬라이드를 선택한다.
2. 다음 수정과 함께 찬드라도스^외(32)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 커버슬립 및 슬라이드의 세척, 염분화, PEGylation 및 챔버 조립을 수행한다.
   1. 초음파 처리로 10% 알칼리성 액체 세제(v/v)에 드릴링된 구멍을 포함하는 슬라이드를 20분 동안 세척합니다. 슬라이드와 커버립을 결합하여 남은 모든 청소 단계를 수행합니다.
   2. 아세톤 워시 스텝을 건너뜁니다. 피라냐 에칭 인큐베이션 시간을 20분에서 1시간으로 연장합니다. 3 시간 동안 1 라운드 PEGylation을 배양. MS(PEG)_4와 함께 2라운드 PEGylation을 3시간 동안 배양합니다.

3. 장비 준비

1. 단일 분자 실험을 수행하기 전에 적어도 3 시간 이상, 현미경 인큐베이터를 켜고 실험의 과도한 음향 장애를 피하기 위해 낮은 속도로 공기 흐름을 감소. 인큐베이터 온도를 세포 없는 번역 시스템의 최적의 온도로 설정합니다.
   참고: 번역은 온도에 매우 민감합니다. 최적의 반응 온도는 각 세포 추출물 시스템에 특이적이다. 반응 온도 특성화는 대량 세포 없는 번역 시스템의 개발에 중요한 단계입니다. 이 단일 분자 분석은 해당 벌크 번역 조건과 동일한 최적의 온도하에서 수행되어야 합니다.
2. 단일 분자 실험을 수행하기 전에 적어도 1 h는 레이저 상자 뒤에 레이저 전원 버튼을 눌러 레이저를 켜고, 레이저 안전 키를 켜고, 시작 버튼을 누릅니다. 현미경을 켜고 터치 스크린 제어판을 눌러 이미징 모드, 목표 및 필터 세트를 선택합니다.
3. 전원 버튼을 눌러 EMCCD 카메라, 이전 스테이지 컨트롤러 및 주사기 펌프를 켭니다. 컴퓨터 및 오픈 소프트웨어 안도르 솔리스(소프트웨어 1)를 켜서 EMCCD 카메라, TirfCtrl(소프트웨어 2)을 제어하여 레이저를 제어하고, 전동 스테이지를 제어하는 선행테스트(소프트웨어 3) 및 냉각식을 제어하여 주사기 펌프를 제어한다. 데이터 수집이 시작되기 전에 카메라가 지정된 작업 온도로 냉각되고 안정화되도록 합니다.
4. 소프트웨어 2에서 올바른 파라미터가 레이저 파장, 유리 및 시료의 굴절 률에 대해 설정되어 있는지 확인합니다. 연결 버튼을 클릭합니다. 레이저 강도를 설정하려면 레이저 파장 옆의 제어 버튼을 클릭한 다음 레이저 컨트롤팝업 창에서 강도 슬라이드 막대를 끕다. 레이저를 원하는 각도로 설정하여 섬유 위치 슬라이드 바를 드래그하거나 해당 침투 깊이를 입력합니다. 이미징이 없을 때 는 Shutter 상자가 꺼진 모드에서 레이저를 유지하도록 선택되었는지 확인합니다.
   참고: 셔터 박스를 확인하여 레이저 셔터를 열고 닫습니다. 처음에 분석서를 확립할 때, 다른 레이저 강도 및 입사 각도는 최적의 단일 분자 검출을 위해 시험되어야 합니다. 최적의 레이저 강도는 밝은 단일 분자 형광과 형광의 빠른 광표백의 균형을 이릅니다. 사고 각도는 mRNA 결합 항체가 명확하게 해결될 때까지 확산 표시 된 항체로부터 높은 형광 배경을 줄이기 위해 임계 각도를 넘어 증가해야합니다. 참고로, 532 nm 레이저는 항체당 2-7 염료의 라벨링 비율을 가진 Cy3 라벨 방지 플래그를 사용하여 연구^15에서 레이저 사고 각도가 71.5°로 설정된 객관적인 10 μW로 설정되었다.
5. 소프트웨어 1에서 획득 모드에서 Kinetic을 선택하고 노출 시간, 운동 계열 길이 및 EM 게인 값에 대한 매개 변수를 입력합니다. 데이터 이미지 파일을 저장하기 위해 디렉터리를 선택하고 파일 이름을 할당합니다.
6. 주사기 펌프를 후속 튜브 세척 단계에 대해 적당한 속도로 빠른 유량으로 설정합니다.
   파이펫은 70% 에탄올의 알리쿼트를 마이크로퓨지 튜브에 넣고, 주사기 펌프 튜브 를 에탄올 용액에 삽입하고, 쿨터레를 사용하여 리펜딩 모드와 디스펜싱 모드 사이에 주사기 펌프를 세 번 토글하여 튜브를 세척합니다. RNase가 없는 물을 사용하여 반복하십시오.
   참고: 튜브 길이는 주사기가 아닌 튜브에만 연락하기 위해 5단계에서 번역 믹스를 분배할 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 여기에 헹구는 볼륨은 5 단계에서 번역 믹스가 소독 튜브와 접촉 유지되도록 분배 번역 믹스의 볼륨보다 커야합니다.
7. 마지막 물 헹구는 분무 후, 깨끗한 티슈 닦아에 튜브 끝을 두드리고 튜브의 내부에서 잔류물을 제거합니다. 깨끗한 미세 분리 튜브로 설정하여 튜브 끝을 건조하게 유지합니다.

4. 3′엔드 바이오티니화 mRNA의 고정

1. 셀 추출물과 번역 믹스를 사용 직전까지 드라이 아이스에 얼어 붙은 유지합니다. 남은 냉동 시약을 해동하고 얼음 위에 보관하십시오.
2. 커버슬립 측이 아래를 향하고 테이프로 고정하여 현미경 샘플 홀더에 유동 챔버를 배치합니다. 테이프를 사용하여 사용하지 않는 유동 채널의 입구와 콘센트를 덮습니다.
3. 파이펫은 1.5배 부피(채널 부피에 상대적, 4단계 및 5단계의 다른 단계에도 적용)의 0.2 mg/mL 스트렙타비딘을 유량 채널로 입력하고 실온에서 10분 동안 배양한다.
4. 언바운드 스트렙타비딘을 제거하려면 세척당 T50 세척 버퍼(20m Tris HCl, pH 7.0, 50mM NaCl, 0.2 U/μL RNase 억제 시약)의 3배 부피로 채널을 세 번 세척한다.
   참고: 액체 폐기물이 채널로 다시 유입되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 유동 채널의 출구가 폐기물 수거 튜브에 연결되지 않은 경우, 접힌 티슈 페이퍼를 콘센트 근처에 놓고 채널에서 흐르는 액체를 흡수한다.
5. 번역 추출물을 옮기고 드라이 아이스에서 얼음으로 섞어 해동할 수 있도록 합니다.
6. 목표에 침지 오일 한 방울을 넣습니다. 현미경 챔버를 가진 현미경 샘플 홀더를 현미경 단계에 놓습니다. 객관적인 오일이 커버슬립에 닿을 때까지 목표를 커버슬립에 가까이 두십시오. 유동 채널의 위치가 목표 렌즈 바로 위에 있도록 샘플 스테이지를 이동합니다.
7. 소프트웨어 2에서 레이저 셔터를 열고 레이저 강도 수준을 조정합니다.
8. 현미경 제어 터치 화면에서 포커스 탭을 선택하고 포커스 검색 및 시작 버튼을 클릭합니다. 포커스 평면이 성공적으로 달성되면 경고음이 울립니다.
9. 소프트웨어 1의 라이브 모드에서 흐름 채널 표면을 이미지합니다. 터치 스크린에서 미세한 스텝 컨트롤로 객관적인 위치를 조정하여 선명한 이미지에 초점을 최적화합니다.
10. 소프트웨어 3에서, 흐름을 채널 검출 표면의 다양한 영역에서 형광 배경의 수준을 평가하기 위해 단계를 이동합니다. 형광이 낮으면 실험을 계속하십시오. 형광 배경이 지나치게 높으면 흐름 채널을 폐기하는 것이 좋습니다.
11. 소프트웨어 2에서 레이저 셔터를 닫습니다.
12. 파이펫은 유량 채널에서 T50 세척 버퍼를 꺼내고 2배의 바이오티니화 된 mRNA 용액에서 유동 채널에 즉시 파이펫을 제거합니다. 15분 동안 배양합니다.
    참고: mRNA 제제의 각 배치에 대해, mRNA 농도 및 잠복기는 단일 분자 검출에 필요한 mRNA 표면 밀도를 달성하기 위하여 시험되어야 합니다. 적절한 mRNA 표면 밀도는 ~5% 이상 겹치지 않고 형광 반점을 보여주는 항체 결합을 중재한다(대표 결과참조). 출발점으로서, 2-20 nM의 농도에서 생체화 된 mRNA를 권장합니다.
13. 세척당 3배의 번역 호환 버퍼를 파이프로 세 번 세척합니다.

5. 단일 분자 검출을 위한 유량 채널로의 번역 혼합 조립 및 전달

1. 얼음에서, mRNA를 생략하고 형광 표지 항체의 최적화된 농도로 보충을 제외하고, 1.7단계에서 벌크 번역 프로토콜에 따라 마이크로센심분리기 튜브에 30개의 번역^믹스를 조립한다. 마이크로원심 분리기 튜브를 잠시 회전하여 튜브 의 하단에 있는 번역 믹스를 수집합니다.
   참고: 분석서를 확립할 때, 다른 항체 농도가 시험됩니다. 최적 농도는 초기 펩티드에 대한 검출 표면 및 빠른 항체 결합에 대한 낮은 양의 비특이적 항체 결합을 나타낸다(각각 7.1 및 7.2단계 참조, 분석 교정 세부 정보 참조).
2. 0.7 mL 마이크로퍼지 튜브 캡의 안쪽으로 번역 믹스를 전송합니다. 주사기 펌프를 인출 모드로 설정합니다. 펌프 튜빙 끝을 번역 믹스에 삽입합니다. 주사기 철수를 시작하여 펌프 튜빙에 번역 믹스를 수집합니다. 주사기 펌프 설정을 디스펜싱 모드로 되돌리고 흐름흐름을 번역 혼합 전달을 위한 최적의 속도로 설정합니다.
   참고: 펌프 튜빙으로 전송할 때 번역 믹스에서 거품을 생성하지 마십시오. 3.6 단계에서 소독되고 헹구지 않은 튜브 의 부분에 번역 믹스를 너무 깊게 철회하지 마십시오. 분석서를 설정할 때, 다른 납품 유량은 최적의 속도를 결정하기 위해 테스트됩니다(분석 캘리브레이션에 대한 자세한 내용은 6.2단계 참조).
3. 튜브 엔드와 번역 혼합물 사이에 간격이 있는 경우 주사기 펌프를 시작하고 번역 혼합물이 튜브 끝에 도달하도록 허용한 다음 주사기 펌프를 중지합니다.
4. 펌프 튜빙 끝을 유량 채널의 입구에 삽입합니다. 연결을 수행할 때 번역 믹스에 기포를 도입하지 마십시오. 맞춤형 금속 브래킷을 현미경 샘플 홀더 플레이트에 나사로 연결하여 연결을 안정화합니다. 현미경 초점 및 화상 진찰 지역 형광을 평가합니다.
   참고: 튜빙은 이전에 설명된^33과같이 사용자 지정 부품으로 유량 챔버에 고정될 수 있다. 유체 시스템의 다른 유형은 또한이 분석^34에사용할 수 있습니다. 관빙을 연결하기 전과 후에 시야가 비슷하게 표시되어야 합니다. 연결 후 형광 반점이 더 많이 나타나면 번역 믹스가 배달 튜브에서 누출 될 가능성이 있습니다. 응용 프로그램에 따라 번역 믹스가 유출된 채널을 폐기해야 할 수 있습니다.
5. 동영상 획득 매개 변수가 올바른지 확인하고 파일 저장을 위해 적절한 파일 이름과 디렉토리를 입력했습니다.
6. 스테이지를 이동하여 유동 채널 감지 표면의 중앙에 있는 영역을 이미지합니다. 현미경 제어 터치 화면에서 연속 AF 탭을 선택하고 초점 검색 및 시작 버튼을 클릭하여 실험 중에 초점 위치를 유지합니다. 포커스 평면이 성공적으로 달성되면 경고음이 울립니다.
7. 소프트웨어 2에서 레이저 셔터를 엽니다. 소프트웨어 1에서 시그널 테이크 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 약 5s의 레코딩 후 쿨기간에 Run 명령을 입력하여 흐름 채널에 번역 믹스를 전달합니다. 0.5-2 s/프레임의 시간 해상도로 최대 2시간 동안 기록합니다.
   참고: 데이터 수집의 최대 범위는 번역 추출물이 시간이 지남에 따라 활동을 잃는 빈도에 따라 달라지며, 이는 루시파라제 리포터 mRNA와 대량 세포 없는 번역을 수행하고 다른 시간^{점(35)에서}번역 반응에서 루시파아제 활동을 측정하는 것이 편리하게 특징지어질 수 있다.
8. 데이터 수집이 완료되면 레이저를 끄고 현미경 제어 터치 스크린에서 연속 AF를 끄고 유동 챔버에서 튜브를 분해합니다.
9. 피펫은 유동 채널 입구에서 번역 혼합물을 꺼내 마이크로퍼지 튜브로 옮기고, 튜브를 액체 질소에 배치하여 용액을 스냅 동결한다. 나중에 -80 °C에 보관하십시오.
10. 주사기 펌프 튜브를 RNase가없는 물로 세 번 씻은 다음 70 %의 에탄올로 세 번 씻으신다. 보관을 위해 70% 에탄올을 주사기 펌프 튜브에 넣습니다.
11. 현미경 및 모든 액세서리를 끕니다. 정리합니다.

6. 데이터 분석

참고: 이 분석법에 대한 데이터 분석은 단일 분자 생물 물리학 연구에서 일반적인 방법이 필요합니다. 기존 알고리즘과 소프트웨어를 사용하여 모든 계산 집약적 단계를 수행할 수 있습니다(참조는 해당 단계에 아래에 포함됨).

1. 선택 사항: 해당되는 경우 획득한 이미지 시리즈 파일을 선택한 이미지 프로세싱 소프트웨어 또는 프로그래밍 언어와 호환되는 형식으로 변환합니다.
2. 번역 반응 시작점 및 시약 교환 시간을 결정합니다.
   참고: 번역 믹스에서 형광 항체가 확산되기 때문에, 번역 호환 버퍼에서 번역 믹스로 채널 내 시약 교환 중에 이미지 영역의 배경 형광 강도가 증가합니다. 번역 반응 시작점은 시약 교환이 완료될 때 시간점으로 설정됩니다. 이러한 완성점은 번역 혼합 전달 중 배경 형광 강도를 측정하고, 아래에 설명된 바와 같이 형광 강도고가 증가할 때의 시점을 식별함으로써 발견된다.
   1. 이미지 프레임당 총 형광 수를 계산하고 해당 시간 프로파일을 플롯합니다. 시간 프로필 플롯에서 총 형광이 급격히 증가하는 지 확인합니다.
      참고: 총 형광 증가는 시약 교환 중에 형광으로 표지된 항체의 농도가 증가하기 때문이다.
   2. 총 형광 증가 단계의 끝점을 식별하고 이 시간 점을 번역 반응의 시작점(즉, 시간 0)으로 설정한다. 총 형광 증가 단계의 시작점과 끝점을 모두 식별하고 시약 교환 시간으로 시차를 설정합니다.
      참고: 시약 교환의 총 시간 범위는 유량 채널 치수및 선택한 유량에 따라 달라집니다. 시약 교환이 완료되기 전에 일부 번역 요인이 mRNA에 바인딩을 시작할 수 있으며 결정된 1라운드 개시 시간의 해결을 줄일 수 있습니다. 따라서 분석기를 설정할 때 다른 유량속도를 테스트하고 0.5-2 s/frame의 데이터 수집 속도에 대해 3-4s 이내에 시약 교환 완료를 허용하는 유량 비율을 선택하는 것이 좋습니다.
3. 선택 사항: 영화 드리프트 보정을 수행합니다.
   참고: 현미경 부품 및 액세서리의 드리프트로 인해 데이터 이미지에서 결합된 항체의 위치는 시간이 지남에 따라 변경될 수 있습니다. 영화에서 시각적으로 눈에 띄는 드리프트는 데이터 분석을 진행하기 전에 수정이 필요합니다. 여러 공간 드리프트 보정 알고리즘 및 스크립트를 사용할 수 있습니다^36,37,38.
   1. 각 이미지에서 픽셀 수의 로컬 최대값을 찾아 각 프레임에서 픽셀 수준 정확도로 바운드 항체의 위치를 결정합니다. 배경 노이즈 위에 명확하게 있는 반점만 선택하도록 픽셀 수에 대한 임계값을 설정합니다.
   2. 두 개의 연속 된 이미지 프레임 사이의 각 방향으로 개별 항체 위치의 변화를 계산합니다.
   3. 두 개의 연속 프레임 사이의 항체 위치 변경의 히스토그램을 플롯하고 각 방향에 대해 별도로 수행합니다. 가우시안은 각 히스토그램에 맞게 두 개의 연속 프레임 사이의 방향 표류로 봉우리의 중심 위치를 설정합니다.
   4. 관찰된 드리프트를 중화하려면 각 이미지 프레임을 계산된 드리프트 량으로 반대 방향으로 이동합니다.
4. 단일 분자 궤적을 구성합니다.
   참고: 감지/추적 소프트웨어는 밝은 반점을 식별하고 데이터 이미지 시리즈^39,40에서강도를 추출할 수 있습니다.
   1. 6.3.1 단계에서 설명된 바와 같이 항체 위치를 식별한다.
      참고: 선택한 임계값이 과도한 과잉 또는 입자 를 과소 또는 언더 피킹으로 증가시키지 않도록 육안 검사는 권장됩니다. 각 이미지 프레임에 식별된 중심 위치를 오버레이하고 해당 동의를 시각적으로 평가하여 육안 검사를 수행할 수 있습니다(대표 결과참조).
   2. 모든 프레임에서 선택한 파티클을 결합하고 중복 파티클 위치를 제거합니다.
   3. 바운드 항체의 이미지를 육안으로 검사하고 배경 위에 명확하게 있고 개별적으로 결합된 항체를 대표하는 카운트로 픽셀을 둘러싸는 정사각형 영역을 선택합니다.
      참고: 포인트 확산 기능(즉, 단일 분자에 대한 사각형의 크기)은 광학 설정 및 검출기 픽셀 크기에 의해 결정됩니다.
   4. 각 입자 위치에 대해, 입자 위치 주위의 제곱 영역의 모든 픽셀의 총 강도를 계산하여 단일 분자 궤적을 구성한다. 궤전은 각 위치, 프레임별 및 전체 데이터 동영상에 대해 구성됩니다.
5. 선택 사항: 단일 분자 궤적에서 배경 잡음을 줄이기 위해 비선형 전방향^{필터(41)를} 적용합니다.
6. 선택 사항: 기존 단계 감지^{알고리즘42,43,44,45로}궤적을 디지털화합니다.
   참고: 단계 감지 알고리즘의 선택은 단일 분자 역학의 복잡성에 따라 달라집니다. 단 하나의 리보솜 번역(즉, 다일부 형성 없음)과 잡음 비에 대한 양호한 신호의 가장 간단한 시나리오의 경우, 형광 수에 대한 임계값 적용은 단일 분자 궤적에서 항체 결합 및 해리 이벤트의 타이밍을 식별하기에 충분하다. 각 조건에 대해 최소 100개의 궤적을 육안으로 검사하여 단계 감지 전략에 의해 궤도 단계를 적절하게 선택하도록 하는 것이 좋습니다.
7. 각 궤적(즉, 처음 도착 시간, t_1)에대한 첫 번째 항체 결합 이벤트의 시간을 디지털화된 궤적을 사용하거나 디지털화되지 않은 궤적에 임계값을 적용하는 시간을 결정합니다.
   참고: 첫 도착 시간 분포의 중간 값은 서로 다른 번역 조건 간에 비교할 수 있습니다. 또는 첫 도착 시간 분포는 이동된(3-매개 변수) 로그-일반 함수에 장착하여 평균 값¹⁵ &t₁>를 결정할 수 있다. 첫 도착 시간 분포는 일반적으로 왜곡되고 꼬리가 길기 때문에 관찰된 첫 도착 시간에 직접 평균을 계산하지 마십시오.
8. 선택 사항: 평균 펩티드 합성 속도의 웰 시간 분석 및 계산.
   1. 디지털화된 궤적을 사용하여 각 궤적에서 단조로운(단일 리보솜) 번역 이벤트를 식별하고 해당 항체 결합 및 해리 이벤트 간의 시차로 단일 바인딩 이벤트 거주 시간을 계산합니다.
      참고: 여러 분자 이벤트가 제 시간에 겹칠 때 궤적을 디지털화하기 위한 단계 감지 알고리즘은 일반적으로 신뢰성이 낮습니다. 따라서 거주 시간 분석에서 다일부 이벤트를 제외하는 것이 좋습니다. 다낭성 이벤트로 농축되고 단조로운 이벤트를 자주 표시하는 고활성 번역 시스템의 경우, 표지된 항체와 라벨이 부착되지 않은 항체의 혼합물을 혼합하여 단일 분자 궤적에서 격리된 번역 이벤트를 관찰할 가능성을 높일 수 있습니다.
   2. 분포를 로그-일반 함수에 맞추고 장착된 함수를 사용하여 평균 거주 시간을 계산합니다.
      참고: 거주 시간 분포가 일반적으로 긴 꼬리로 왜곡되기 때문에 관찰된 거주 시간을 평균화하여 평균을 직접 계산하는 것은 권장되지 않습니다.
   3. 에피토프 아미노산 길이및 35(리보솜 출구 터널 내의 초기 펩타이드의 평균 아미노산 길이)의 합을 ORF 코돈의 총 수로부터 빼내어 항체 결합 거주 시간 동안 번역되는 아미노산의 수를 결정한다.
   4. 평균 펩티드 합성 속도를 결정하려면 번역된 아미노산의 수를 평균 거주 시간으로 나눕니다.
9. 선택 사항: 평균 1라운드 개시 시간 계산(&t_{1_I}>).
   참고: 개시 부위 서열 컨텍스트 및 코딩 서열과 같은 개시 및 신장 조건은 일반적으로 개시 운동 연구를 위해 의도적으로 보존됩니다. 따라서 6.7 단계에서 평균 첫 도착 시간 &t₁>. 다른 조건 간의 첫 번째 라운드 개시 운동에서 변화를 계산하기 위해 직접 사용할 수 있습니다. 다음 수정은 1라운드 개시 시간의 실제 값을 결정하는 데만 필요합니다.
   1. 에피토프 길이와 35(리보솜 출구 터널 내의 초기 펩타이드의 평균 아미노산 길이)를 평균 펩타이드 합성 속도(단계 6.8.4.에서)로 나누어 이 N단측 영역의평균 펩티드 연도 시간을 계산한다(&t 1_tag>).
   2. 첫 번째 도착 시간은 1 라운드 개시 시간과 t_{1_tag,}빼기 &t_{1_tag}> 평균 첫 도착 시간 & t₁> 평균 첫 번째 라운드 개시 시간&t_{1_I}>; <t1_I > <_{1_I;}t >_{1_tag;}t >

7. 분석 보정

참고: 먼저 분석서를 설정할 때 다음 교정 단계를 수행합니다.

1. 항체 결합 특이성을 검사하기 위해 태그가 지정되지 않은 mRNA(도2)에대해 4항 및 5절에서 프로토콜 단계를 별도로 수행한다. 이들 각각의 mRNA를 가진 채널에서항체 결합 수준은 초기 펩티드에 검출 표면 및 특정 항체 결합에 결합하는 비특이적 항체 결합의 정도를 나타낸다.
   참고: 비특이적 결합 비에 특이적인 것은 >10이어야 하며 다른 표면 통과 전략, 낮은 항체 농도 또는 더 높은 mRNA 표면 밀도로 증가할 수 있다.
2. 항체 결합의 비율을 측정하기 위하여는, 단계 4와 단계 5 사이 추가 단계로 프로토콜을 수행합니다.
   1. 4단계 후, mRNA/리보솜/펩타이드 복합체를 미리 생성하는 항체가 부족한 번역 혼합물로 채널을 배양한다.
   2. 그런 다음 5단계로 진행하여 항체 보충 번역 혼합물을 채널로 플로우한다.
   3. 첫 도착 시간 히스토그램에 지수 피팅으로 미리 생성된 초기 펩티드에 대한 평균 항체 결합 속도를 정량화한다.
      참고: 미리 생성된 펩타이드에 대한 항체 결합은 초 단위로 빠르며 번역 운동보다 빠를 수 있습니다. 항체 농도가 높을수록 항체 결합률을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
3. 불소 표지 항체의 광안정성.
   1. 2단계에서 프로토콜에 따라 슬라이드를 준비하지만 PEGylation 단계를 건너뜁니다. 살리니화 단계 후 유동 챔버를 조립한다. 시란 코팅은 검출 표면에 효율적인 비특이적 항체 결합을 허용합니다.
   2. 형광 표지 된 항체를 채널에 추가하여 검출 표면에 결합하는 비특이적 항체의 단일 분자 밀도를 달성합니다. T50 세척 완충제에서 고도로 희석되는 형광 표지 항체를 첨가하고 원하는 단일 분자 밀도가 달성될 때까지 항체 농도를 점진적으로 증가시한다.
   3. 대부분의 항체 형광이 더 이상 검출되지 않을 때까지 검출 표면을 이미지합니다.
   4. 형광 표백으로 인한 항체 형광 손실의 비율을 평가하기 위해 시간이 지남에 따라 눈에 보이는 항체의 총 수를 플롯.
      참고: 항체 라벨링은 전형적으로 항체 당 여러 형광을 산출합니다. 개별 항체는 모든 공자 형광표 photobleach까지 검출가능한 남아 있습니다.

결과

설명된 프로토콜에 따라 3'엔드 테더드 리포터 mRNA(그림1)의활성 세포 무분별 번역 동안 단일 분자 분해능을 가진 초기 N 단말 태그 폴리펩티드와개별 항체 상호작용의 이미징을 가능하게 한다. 최소 데모 실험은 3개의 합성 mRNA를 사용하여 보고됩니다: LUC (태그되지 않은 루시파라아제를 인코딩), LUC_FLAG (3xFLAG 태그 루시파라아라기), 마력-LUC_FLAG (5'리더 영역에서 안정적인 줄기 루프가 있는LUC_FLAG) (그림 2C). 루시파라제-인코딩 mRNA를 사용하면 단일 분자 관측과 대량 발광 측정 사이의 비교가 가능합니다. 3' 바이오티니졸트 mRNA의 무결성은 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE) 및 RNA 염색...

토론

전형적인 시험관내 TIRF 단일 분자 실험과 비교하여, 여기에 기재된 분석기를 사용한 단일 분자 이미징은 세포 추출물의 사용과 형광으로 표기된 항체의 고농도로 인해 더욱 복잡하다. 표면 PEGylation의 한 라운드의 일반적인 관행에 비해, PEGylation (단계 2)의 두 번째 라운드는 검출 표면^(15)에비특이적 항체 결합을 크게 감소시킨다. 확산형광 항체의 고농도는 항체 결합의 단일 분자 검출을 마스크하는 매우 높은 형광 배경을 일으킵니다. 이러한 형광 배경을 줄이기 위해 레이저 사고 각도가 임계 각도(단계 3.4.)보다 훨씬 높게 증가합니다. 항체 검출은 또한 과도한 불소 불안정에 의해 감소되어 거주 시간을 정량화하는 능력을 제한할 수 있습니다. 이 문제가 발생할 때, 플루오로포어를 삼중 주^{대기중(47)에}접합한 것과 같은 더 광적인 플루오로포어로 교체하거나 레이저 조명 강도를 낮춥니다. 산소 청소 시스템은 일반적으로 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100X 오일 대물렌즈, NA 1.49	Olympus	UAPON 100XOTIRF
아크릴아미드/비스(40%, 19:1)	Bio-Rad	161-0144
알칼리성 액체 세제	Decon	5332
아미노실란(N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란)	UCT Specialties, LLC	A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD	Andor	DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis 소프트웨어	Andor		EMCCD
대역 통과 필터	Chroma	532/640/25
대역 통과 필터	Chroma	NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio Inc	Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid	Prolume	309-250
Coolterm 소프트웨어			주사기 펌프 제어용
데스크탑 컴퓨터	Dell		현미경, 카메라, 스테이지 및 펌프를 제어합니다.
이색성 거울	Semrock	R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX	Fisher Scientific	NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Epoxy	Devcon	14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid	Prolume	306-250
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	BP1185500
산화수소 시	그마-알드리치	216763-500ML
이멀젼 오일	올림푸스	Z-81226A	저자동 형광
루시페라제 분석 시스템	Promega	E1500
MEGASCRIPT T7 전사 키트	써모 피셔	AM1334
메탄올	피셔 과학	MMX04751
현미경	Olympus	IX83
현미경 슬라이드	Thermo Scientific	3048
단클론 항 FLAG M2-Cy3	Sigma-Aldrich	A9594
mPEG-SVA	Laysan Bio Inc	mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4	Thermo Scientific	22341
NaCl (5M)	Thermo Scientific	AM9760G
No 1.5 현미경 커버 유리	Fisherband	12-544-C
올림푸스 레이저, 532nm 100mM	올림푸스 디지털 레이저 시스템	CMR-LAS 532nm 100mW
올림푸스 TirfCtrl 소프트웨어	올림푸스		레이저 강도 및 입사각 제어용
광학 테이블	TMC 진동 제어	63-563	진동 절연 포함
페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올 혼합물	Sigma-Aldrich	77617-100ml
피어싱 RNA 3' 엔드 바이오티닐화 키트	Thermo Scientific	20160
수산화칼륨 펠릿	Sigma-Aldrich	P1767-500G
Prior motorized XY translation stage	Prior	PS3J100
Prior PriorTest 소프트웨어	이전		전동 스테이지 제어를 위해
재조합 RNasin RNase Inhibitor	Promega	N2515
스테이지 상단 인큐베이터	In vivo scientific (world precision instruments)	98710-1	맞춤형 아크릴 케이지
염색 용기	포함 Fisher Scientific	08-817
Streptavidin	Thermo Scientific	43-4301
황산	Fisher Scientific	A300212
SYBR green II	Fisher Scientific	S7564
주사기	Hamilton	1725RN
주사기 펌프	Harvard 장치	55-3333
Tris (1M), pH = 7.0	Thermo Scientific	AM9850G
초음파 수조	Branson
요소	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Vaccinia 캡핑 시스템	New England Biolabs	M2080S
Zymo-Spin IC 컬럼	Zymo Research	C1004