개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.
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방법 논문
캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석
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이 논문에서
요약
초록
캡 의존성 단백질 합성은 진핵 세포에서 주요 번역 경로입니다. 다양한 생화학 적 및 유전 적 접근은 캡 의존 성 번역 및 규제의 광범위한 연구를 허용했지만,이 번역 경로의 고해상도 운동 특성화는 여전히 부족합니다. 최근에는 단일 분자 분해능으로 캡 의존형 번역 운동학을 측정하기 위한 체외 분석서를 개발했습니다. 상기 분석법은 초기 에피토프 태그폴리펩티드에 형광표지 항체 결합을 기반으로 한다. 초기 펩타이드-리보솜-mRNA 복합체를 통해 항체의 결합 및 해리를 이미징함으로써 개별 mRNA에 대한 번역 진행을 추적할 수 있다. 여기서는 mRNA 및 PEGylated 슬라이드 제제, 번역의 실시간 이미징 및 단일 분자 궤적 분석을 포함한 이 분석 방법을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 개별 캡 종속 번역 이벤트를 추적할 수 있게 해주며 개시 및 신장 속도와 같은 주요 번역 역학을 해결합니다. 분석은 뚜렷한 번역 시스템에 널리 적용될 수 있으며 캡 의존성 번역 역학 및 번역 제어 메커니즘의 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.
서론
진핵 계통에서의 번역은 주로 7-메틸구아노신(m7G) 캡 의존경로1을통해 발생한다. 연구에 따르면 진핵 번역의 개시 단계는 속도 제한및 규정2,3,4에대한 공통의 목표임을 나타낸다. 캡 의존형 번역의 메커니즘은유전5,생화학6,7,8,구조9,및 게놈10 벌크 접근법을 사용하여 광범위하게 연구되었다. 이러한 방법은 캡 의존개시를 조절하는 다양한 메커니즘을 확인했지만, 해상도는 이기종 및 비동기 개시 이벤트에서 신호의 평균을 앙상블로 제한합니다. 최근에는 생체내 번역 이벤트가 초기 폴리펩티드(11,12,13,....
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프로토콜
1. 기자 mRNA의 세대
- "태그가 붙은" 기자 mRNA(그림2A)에대한 DNA 전사 템플릿을 생성하기 위해 N-terminus 에피토프 태그 인코딩 서열을 삽입하여 벌크 분석 "태그해제" 기자 mRNA를 인코딩하는 DNA 전사 템플릿을 수정한다.
참고: 뛰어난 감도와 짧은 3xFLAG 태그 길이로 인해 이 분석에 3xFLAG/안티 플래그 상호 작용이 권장됩니다. 그러나, 분석은 다른 에피토프/항체 쌍과 호환된다. - 선형화된 DNA 템플릿과 시험관 내 전사 키트를 사용하여 태그가 지정되지 않고 태그가 지정된 RNA를 합성합니다(재료 표참조). 전형적으로, 시험관내 전사 RNA의 10-20 pmol은 체계적인 단일 분자 연구를 허용하기 위하여 후속 RNA 처리를 위해 충분합니다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 M7G 캡핑 키트(재료 표참조)를 장착한 RNA 5′ 엔드(그림2B)를캡핑합니다.
- 생체화 키트(재료표 참조)를 사용하여 RNA 3′엔드(도 2B)를
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결과
설명된 프로토콜에 따라 3'엔드 테더드 리포터 mRNA(그림1)의활성 세포 무분별 번역 동안 단일 분자 분해능을 가진 초기 N 단말 태그 폴리펩티드와개별 항체 상호작용의 이미징을 가능하게 한다. 최소 데모 실험은 3개의 합성 mRNA를 사용하여 보고됩니다: LUC (태그되지 않은 루시파라아제를 인코딩), LUCFLAG (3xFLAG 태그 루시파라아라기), 마력-LUCFLAG (5'리더 영역에서 안정적인 줄기 루프가 있는LUCFLAG) (그림 2C). 루시파라제-인코딩 mRNA를 사용하면 단일 분자 관측과 대량 발광 측정 사이의 비교가 가능합니다. 3' 바이오티니졸트 mRNA의 무결성은 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE) 및 RNA 염색.......
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토론
전형적인 시험관내 TIRF 단일 분자 실험과 비교하여, 여기에 기재된 분석기를 사용한 단일 분자 이미징은 세포 추출물의 사용과 형광으로 표기된 항체의 고농도로 인해 더욱 복잡하다. 표면 PEGylation의 한 라운드의 일반적인 관행에 비해, PEGylation (단계 2)의 두 번째 라운드는 검출 표면(15)에비특이적 항체 결합을 크게 감소시킨다. 확산형광 항체의 고농도는 항체 결합의 단일 분자 검출을 마스크하는 매우 높은 형광 배경을 일으킵니다. 이러한 형광 배경을 줄이기 위해 레이저 사고 각도가 임계 각도(단계 3.4.)보다 훨씬 높게 증가합니다. 항체 검출은 또한 과도한 불소 불안정에 의해 감소되어 거주 시간을 정량화하는 능력을 제한할 수 있습니다. 이 문제가 발생할 때, 플루오로포어를 삼중 주대기중(47)에접합한 것과 같은 더 광적인 플루오로포어로 교체하거나 레이저 조명 강도를 낮춥니다. 산소 청소 시스템은 일반적으로 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 건강의 국가 학회 [R01GM121847]에 의해 지원되었다; 기념 슬론 케터링 암 센터 (MSKCC) 지원 보조금 / 핵심 보조금 (P30 CA008748); MSKCC 기능 유전체학 이니셔티브.
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재료
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| 아미노실란(N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis 소프트웨어 | Andor | EMCCD | |
| 대역 통과 필터 | Chroma | 532/640/25 | |
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참고문헌
- Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5
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재인쇄 및 허가
