이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 시설이 개발되었습니다. 이 시설은 실온에서 많은 수의 작은 결정을 측정하기 위해 대용량 분자 결정학 (MX2) 빔 라인의 일환으로 고점성 인젝터 인Lipidico를 통합합니다. 이 기술의 목표는 크리스탈을 유리 주사기로 재배/전송하여 직렬 결정학 데이터 수집을 위한 인젝터에 직접 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 인젝터의 장점은 스트림의 중단없이 유량의 변화에 신속하게 대응하는 기능을 포함한다. 이 높은 점도 인젝터 (HVI)에 대한 몇 가지 제한은 허용 된 샘플 점도에 대한 제한을 포함하는 존재 >10 Pa.s. 스트림 안정성은 샘플의 특정 특성에 따라 문제가 될 수도 있습니다. 샘플을 설정하고 호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 인젝터를 작동하는 방법에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법은 리소지메 결정의 높은 점성 매체(실리콘 그리스)로의 전송을 포함한 시료의 제조를 시연하고, MX2에서 데이터 수집을 위한 인젝터의 작동을 보여 준다.
서론
직렬 결정학(SX)은 X선 자유 전자 레이저(XFELs)1,2,3,4의맥락에서 처음에 개발된 기술이다. 고정 대상 접근법은 SX5,6,7,전형적으로 사용될 수 있지만 인젝터 시스템은 연속 스트림에서 X선 빔에 크리스탈을 전달하기 위해 사용됩니다. 많은 수의 결정으로부터의 데이터를 결합하기 때문에 SX는 실험 중에 모든 결정 정렬의 필요성을 피하고 실온8,9에서데이터를 수집할 수 있게 한다. 적합한 인젝터의 도움으로, 결정은 X선 상호작용 영역으로 하나씩 스트리밍되고 그 결과 회절 데이터는 영역 검출기9,10에서수집된다. 현재까지 SX는 종래의 결정학을 사용하여 측정하기에는 너무 작은 결정을 포....
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프로토콜
1. 유리 주사기를 사용하여 높은 점성 매체에서 결정의 준비
- 결정 용액을 부드럽게 원심분리(~1,000xg, 22°C에서 ~10분)하여 부드러운 크리스탈 펠릿을 형성하고 과잉 버퍼를 제거합니다. 이것은 데이터 수집에 사용될 수 있는 펠릿에 있는 결정의 고농도 귀착될 것입니다.
참고: 점성 매체의 희석을 방지하기 위해 이 단계에서 결정 농도를 증가시다. 각 시료에 대한 점성 매체의 비율을 최적화하여 고농도의 결정을 획득하는 동시에 미디어에 대한 높은 점도를 유지합니다. 결정용액을 원심분리하여 펠릿을 형성하고 과도한 버퍼를 제거하여 다마닌 에 설명된 바와 같이 용액의 결정 농도를 증가시다. al.29. - 커플러로 100 μL 주사기 두 개를 설정합니다.
- 첫 번째 주사기 의 끝에 커플러를 고정하고 주사기의 상단에 결정 용액의 28 μL을 추가합니다. 천천히 플런저를 주사기 의 상단에 삽입하고 부드럽게 결합기 팁의 끝으로 용액을 밀어 형성되는 기포를 제거합니다. 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 따라 이 작업을 수행합니다.
참고: 고점성 매체에 첨가되는 결정의 부피는 전체 시료의 점도를 크게 변화시키지 않으면 다양할 수 있다.- 첫 번째 방법: 급속한 압력 변....
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결과
Lipidico는 MX2(그림 1)에사용하기위한 대체 배달 시스템으로 구축 된 HVI입니다. 크리스탈이 립디큐피너 단계에서 재배되거나 고점성 불활성 매체로 옮겨지는 SX에 이상적입니다.
리조지메 결정과 혼합된 인젝터 애플리케이션 실리콘 그리스를 시연하기 위해 호주 싱크론의 MX2 빔라인에서 SX 데이터를 수집하는 데 사용되었다. MX2 빔라인에 인젝터를 탑재하려면 극저온 노즐이 도 1에도시된 바와 같이 인젝터로 제거되고 대체된다. 주사기 샘플은 인젝터에 직접 장착되고 O-링(도1B)을사용하여 고정됩니다. 샘플 변경 후 몇 분 내에 데이터 수집을 시작할 수 있습니다. 인젝터는 SX에 익숙하지 않은 사용자를 위해 조작하기 쉬운 간단한 설정으로 빠른 샘플 제어를 위해 설계되었습니다.
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토론
대체 HVI가 개발되어 싱크로트론 소스에서 SX 실험을 수행하는 데 이상적입니다. 기존 HV에 비해 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 기존의 결정학과 SX 를 빠르게 전환할 수 있도록 빔라인에 설치하기 쉽고, MX2의 설치 및 정렬에 불과 ~30분이 소요된다. 둘째, 결정을 성장시키는 데 사용되는 샘플 주사기는 직접 주입을 위한 저수지로서 사용될 수 있으며, 시료 전달 시 낭비를 제한할 수 있다. 샘플 변경 프로토콜이 설명되고 입증되었습니다. 이 설계는 다른 HV에 비해 제트를 제어하는 복잡한 가스 스트림의 필요성을 제거합니다. 인젝터의 유량을 변경하는 간단한 프로세스가 지연된 응답 없이 조정할 수 있는 것으로 나타났다.
성공적인 SX 데이터 수집을 위한 가장 중요한 단계는 결정 농도를 최적화하고, 점도가 높은 매체의 균일한 혼합물을 획득하고, 데이터 수집을 위한 안정적인 스트림을 생성하는 것입니다. 최적의 결정 농도와 균질성은 결정을 펠릿으로 원심분리하고 캐리어 미디어에 .......
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공개 사항
MK는 쿠셀 디자인에 대해 작업합니다. 커스텀 실험실 장치 개발자인 Kusel Design은 라 트로브 대학의 피터 벤슨 박사와 ANSTO의 톰 카라독 데이비스 박사와 계약을 맺고 호주 싱크로트론의 MX2 빔 라인에서 높은 점도 연구를 가능하게 하는 저비용 장치를 개발했습니다. 이 장치는 카라독 데이비스 박사와 긴밀한 협의로 개발되었습니다. 저자는 경쟁 적인 재정적 이익이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 고급 분자 이미징 (CE14010001)의 우수성호주 연구 위원회 센터에 의해 지원되었다 (ce140100011) (http://www.imagingcoe.org/). 이 연구는 ANSTO의 일부인 호주 싱크로트론의 MX2 빔라인을 사용하여 부분적으로 착수되었으며 호주 암 연구 재단 (ACRF) 검출기를 사용했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 암탉 달걀 흰자 라이소자임 | Sigma-Aldrich | L6876 | 주입기 테스트를 위한 결정을 성장시키는 데 사용되며, 결정은 실리콘 그리스로 전달됩니다. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| 고진공 실리콘 그리스 | Dow Corning | Z273554-1EA | 주입기 테스트에 사용됩니다. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| 주입기 바늘 (108 µ m ID) | 해밀턴 | 부품 번호: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| 유리 기밀 주사기, 100 &마이크로; l | Hamilton | 부품 번호 : 7656-01 | 샘플 주입에 사용되는 주사기. www.hamiltoncompany.com |
| LCP 주사기 커플러 | Formulatrix | 209526 | 샘플을 혼합하는 주사기 커플러 |
| Lipidico 인젝터 | La Trobe Univerity / ANSTO | 이것은 La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility를 통해 액세스 할 수있는 특정 장비입니다. |
참고문헌
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Pro....
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재인쇄 및 허가
