여기에 제시된 프로토콜은 다색 계통 추적 및 최근접 이웃 모델링을 사용하여 마우스의 성장 및 재생 중에 클론 유래 심근세포를 식별하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근 방식은 객관적이고 다양한 라벨링 조건에서 작동하며 다양한 이미지 분석 파이프라인을 통합하도록 조정할 수 있습니다.
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여기에 제시된 프로토콜은 다색 계통 추적 및 최근접 이웃 모델링을 사용하여 마우스의 성장 및 재생 중에 클론 유래 심근세포를 식별하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근 방식은 객관적이고 다양한 라벨링 조건에서 작동하며 다양한 이미지 분석 파이프라인을 통합하도록 조정할 수 있습니다.
손실되거나 기능 장애가 있는 심근을 대체함으로써 조직 재생은 심부전을 치료할 수 있는 유망한 접근 방식입니다. 그러나 진정한 심장 재생을 감지하는 것은 잠재적인 재생 인자의 검증을 제한합니다. 새로운 심근세포를 검출하는 한 가지 방법은 클론 분석을 통한 다색 계통 추적입니다. 클론 분석 실험은 너무 희박한 라벨링 조건은 심근세포 증식과 같은 드문 이벤트에 대한 민감도가 부족하고 확산 라벨링은 클론을 분해하는 능력을 제한하기 때문에 수행하기 어려울 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 심근세포 클론을 해결하기 위해 최근접 이웃 분포의 통계적 모델링을 사용하여 신생아 마우스 심장의 클론 분석을 수행하는 프로토콜입니다. 이 접근법은 다양한 라벨링 조건에서 클론을 분리할 수 있게 하고 심근세포 증식 및 재생을 정량화하기 위한 강력한 분석 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 조직에 적용할 수 있으며 조직 재생을 연구하는 데 광범위하게 사용할 수 있습니다.
심부전의 조직학적 특징은 손상, 노화 또는 세포사멸 후 심근세포(CM)의 소실입니다1. 조직 재생을 통해 손실되거나 기능 장애가 있는 심근을 보충하는 것은 심부전 환자를 치료하기 위한 잠재적인 치료 전략입니다. 지난 수십 년 동안 발달 및 재생 생물학의 획기적인 발전으로 포유류의 심장이 손실된 CM을 보충하는 능력이 제한되어 있다는 사실이 밝혀졌습니다 2,3,4,5. 이 흥미로운 연구는 타고난 성장 메커니즘이 재생을 위해 배치될 수 있는 가능성을 제기했습니다. 성인 포유류의 심장에는 선천성 재생 반응이 기능적으로 없기 때문에 치료적 심장 재생이 실현되기 위해서는 내인성 복구의 견고성을 향상시키는 방법이 필요합니다.
선천성 심장 재생의 메커니즘은 종에 걸쳐 보존되는 것으로 보입니다. 부상 후 기존 CM이 증식하여 제브라피시 6,7, 도마뱀
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생쥐를 다루고, 생존 수술을 수행하고, 심장을 적출하는 모든 절차는 지역 기관 동물 사용 위원회의 승인을 필요로 합니다.
1. CM의 클론 분석을 위한 마우스
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신생아 냉동 손상에 대한 프로토콜을 따르면 부상이 있거나 없는 P21 심장이 생성되어야 합니다. 냉동 손상 된 심장은 잘 둘러싸인 상처를 가지고 있지만 가짜 심장의 표면은 매끄럽고 균질합니다. 냉동 손상 심장의 경우 부상 부위는 심장에서 심장으로 일관되어야 합니다. 현미경 검사 후 그림 1과 유사한 이미지를 얻어야 합니다. 이미지 해상도를 통해 개별 CM을 식별할 수 있으며 이미징 조건을 통해 각 형광단을 분리할 수 있습니다. 또한, 부상이 클수록 재생 반응이 감소할 수 있으므로 부상은 경벽이 아니라는 점에 유의하십시오23,31. 이미지 분할 후, 각 섹션의 각 형광단에 대해 CM 좌표가 있는 파일을 얻었습니다(그림 2C). 제시된 분석을 위해 총 81개의 절편이 사용되었습니다(46개는 냉동 손상 심장에서, 35개는 가.......
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Multicolor 계통 추적은 단일 세포 해상도로 장기 성장 패턴을 식별하는 강력한 접근 방식입니다. 그러나 다색 계통 추적의 주요 한계는 세포의 희소 라벨링이 필요하다는 것인데, 이는 희귀 이벤트를 식별하기 위한 민감도를 감소시킬 수 있습니다. 실질 세포 회전율이 낮은 것으로 악명 높은 심장과 같은 장기의 경우, 이는 성장 반응을 과소평가하는 결과로 이어질 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 신생아 마우스의 성장 및 재생 중 CM 확장에 대한 클론 분석을 수행하기 위한 단계별 프로토콜입니다. 가장 중요한 것은 최근접 이웃 분포로 클론 확률을 모델링하여 클론을 식별하기 위한 분석 프레임워크가 제공된다는 것입니다. 이 접근법은 증식하는 세포가 서로 매우 근접해 있으며 친족 세포의 광범위한 이동이 예상되는 시스템에 적용되지 않을 수 있다고 가정합니다.
이 접근 방식은 클론 분석에 몇 가지 이점을 제공합니다. 이전의 다색 계.......
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이 연구는 R03 HL144812(RK), Duke University Strong Start Physician Scientist Award(RK), Mandel Foundation Seed Grant(RK) 및 T32 HL007101 Training Grant(DCC)의 지원을 받았습니다. 또한 쥐 사육에 도움을 주신 Evelyn McCullough님과 도움이 되는 의견과 토론을 해주신 Douglas Marchuk 박사님과 Matthew Detter님께 감사드립니다. 마지막으로, R26R-Rainbow 마우스를 친절하게 제공해 주신 Purushothama Rao Tata에게 감사드립니다.
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